甲型肝炎-乙型肝炎-戊型肝炎三聯(lián)疫苗的免疫原性研究.pdf

1、病毒性肝炎(viral heptitis)是由多種肝炎病毒引起的常見傳染病,我國是病毒性肝炎的高發(fā)區(qū),在法定報告?zhèn)魅静≈?。病毒性肝炎的發(fā)病率占首位。甲型肝炎(hepatitis A,HA)是由甲型肝炎病毒(HAV)引起的急性病毒性肝炎,通過糞一口途徑傳播。乙型肝炎(hepatitis B,HB)是由乙型肝炎病毒(HBV)感染所導(dǎo)致的常見傳染病之一,廣泛流行于世界各國,我國是HB的高發(fā)地區(qū)。戊型肝炎(hepatitis E,HE)是一種經(jīng)

2、糞-口途徑傳播的急性傳染病,在世界各地發(fā)展中國家廣泛流行,嚴(yán)重危害人類健康。 2000年,中國第一支自主知識產(chǎn)權(quán)的HealiveTM甲肝滅活疫苗經(jīng)歷四年研制取得成功。乙型肝炎疫苗已上市多年,大量臨床實踐證明,是預(yù)防乙型肝炎的安全有效措施。目前HEV疫苗尚未最終研制成功,用基因工程手段表達HEV主要結(jié)構(gòu)蛋白作為HEV疫苗已成為研究的主要方向。本實驗室以往應(yīng)用抗原mapping技術(shù)和基于PCR的體外中和實驗發(fā)現(xiàn)HEV的中和抗原表位位

3、于HEV ORF2編碼蛋白C端的第452-617位氨基酸之間,在此基礎(chǔ)上,采用原核表達系統(tǒng),表達含有HEV中和抗原表位的p179,動物實驗表明,該蛋白可誘導(dǎo)出高滴度的抗-HEV中和抗體,具有良好的免疫原性。 聯(lián)合疫苗是含有兩種或兩種以上抗原,能夠預(yù)防兩種或兩種以上疾病的疫苗制品。由于各型肝炎病毒之間沒有交叉免疫,同一個體可以感染兩種或兩種以上肝炎病毒。多重肝炎病毒感染較單一病毒感染的病情重,臨床愈后較差。因此,研發(fā)病毒性肝炎聯(lián)合

4、疫苗對有效控制病毒性肝炎有重要意義。 董晨在研究甲肝-戊肝聯(lián)合疫苗時發(fā)現(xiàn)聯(lián)合疫苗誘導(dǎo)小鼠產(chǎn)生的戊肝抗體滴度高于同劑量單價戊肝疫苗,聯(lián)合疫曲誘導(dǎo)小鼠產(chǎn)生的甲肝抗體滴度不低于同劑量的單價甲肝疫苗,甲肝-戊肝聯(lián)合疫苗中,甲肝抗原成分可能起一個類似佐劑的作用,能增強戊肝抗原成分的免疫原性；張敏在研究乙肝-戊肝聯(lián)合疫苗中發(fā)現(xiàn)當(dāng)聯(lián)合疫苗中乙肝抗原和戊肝抗原濃度合適時,聯(lián)合疫苗誘導(dǎo)小鼠產(chǎn)生的抗-HBs IgG和抗-HEV IgG不低于同劑量單

5、價乙肝和單價戊肝疫苗。鑒于聯(lián)合疫苗的諸多優(yōu)點以及我國HA、HB、HE高度流行,重疊感染率不斷增加的現(xiàn)狀,開展了實驗性甲型肝炎-乙型肝炎-戊型肝炎聯(lián)合疫苗(甲肝-乙肝-戊肝聯(lián)合疫苗)的研究,分析三種抗原成分的相互作用以及最佳的劑量配比。本研究主要分為以下兩個部分： 一、實驗性甲型肝炎滅活疫苗的制備及其免疫原性的研究 用HLF、MRC5、Vero、FRhK-4細(xì)胞分別培養(yǎng)HAV(HM175株),不同時間點收獲HAV,對收獲后

6、的病毒進行感染性滴度和培養(yǎng)周期比較。FRhK-4轉(zhuǎn)瓶培養(yǎng)HAV,經(jīng)密度梯度離心、滅活、定量,制備實驗性甲肝滅活疫苗。不同劑量的實驗性甲肝滅活疫苗和不同劑量的市售疫苗HealiveTM免疫小鼠,比較小鼠抗-HAV抗體出現(xiàn)的陽性率和抗體水平,分析實驗性甲肝滅活疫苗的免疫原性。 結(jié)果顯示,HAV接種到FRhK-4細(xì)胞培養(yǎng),兩天后出現(xiàn)CPE,至第6天時CPE達到+++。其它3種細(xì)胞以及陰性對照瓶均沒有出現(xiàn)CPE。HLF、MRC5、Ver

7、o培養(yǎng)的HAV分別在第36d、第27d、第21d時病毒產(chǎn)量達到高峰,其病毒感染滴度分別為5.00 logCCID50/0.1ml、7.67 logCCID50/0.1ml、7.00 logCCIDso/0.1ml,FRhK-4細(xì)胞培養(yǎng)的HAV第3d感染性滴度為5.33 logCCID50/0.1ml,在第6d達到7.33 kgCCID50/0.1ml。由SDS-PAGE電泳圖可知:HAV衣殼蛋白由分子量大約為33KD、29KD、23KD

8、的VP1、VP2、VP3組成。實驗性甲肝滅活疫苗512 ELISA Unit(EU)組與市售HealiveTM20Unit(U)組免疫小鼠后,平均抗體水平在第4、6、8周差別均無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05),提示實驗性甲肝滅活疫苗具有良好的免疫原性,能使小鼠產(chǎn)生良好的免疫應(yīng)答,為甲肝-乙肝-戊肝聯(lián)合疫苗的制備提供了良好的基礎(chǔ)。 二、交叉劑量配比的實驗性甲型肝炎-乙型肝炎-戊型肝炎三聯(lián)疫苗的免疫原性研究 采用8種不同劑量配比

9、的實驗性甲肝-乙肝-戊肝聯(lián)合疫苗A512+B2.5+E5、A512+B2.5+E2.5、A512+B1.25+E5、A512+B1.25+E2.5、A256+B2.5+E5、A256+B2.5+E2.5、A256+B1.25+E5、A256+B1.25+E2.5分別免疫8組小鼠,單價甲肝滅活疫苗512EU、256EU和單價乙肝疫苗2.5μg、1.25μg以及實驗性單價戊肝疫苗5μg、2.5μg免疫作為對照,采用間接ELISA法檢測小鼠血

10、清特異性抗體。探討聯(lián)合疫苗中甲肝抗原、乙肝抗原和重組HEV-p179抗原三種組分間的相互作用。 研究證實,A512組誘導(dǎo)小鼠產(chǎn)生的抗-HAV抗體水平在免疫后第4、8、20周明顯高于A256組；B 1.25組抗-HBs IgG抗體水平與B2.5組全程差異無統(tǒng)計學(xué)意義:E2.5組和E5組小鼠戊肝抗體水平全程無明顯籌異。當(dāng)聯(lián)合疫苗中乙肝抗原、戊肝抗原劑量相同而甲肝抗原劑量不同時,含高劑量甲肝抗原的聯(lián)合疫苗組誘導(dǎo)小鼠產(chǎn)生的甲肝抗體高于含

11、低劑量甲肝抗原的聯(lián)合疫苗組；當(dāng)聯(lián)合疫苗中甲肝抗原、戊肝抗原劑量相同而乙肝抗原劑量不同時,聯(lián)合疫苗中不同劑量乙肝抗原誘導(dǎo)小鼠產(chǎn)生的抗-HBs抗體水平在整個實驗過程中無顯著差異；當(dāng)聯(lián)合疫苗中甲肝抗原、乙肝抗原劑量相同而戊肝抗原劑量不同時,聯(lián)合疫苗中不同劑量戊肝抗原誘導(dǎo)小鼠產(chǎn)生的抗-HEV抗體水平在整個實驗過程中差異無明顯統(tǒng)計學(xué)意義。經(jīng)統(tǒng)計分析得出A512+B1.25+E2.5組和A512+B2.5+E2.5組中甲肝、乙肝、戊肝抗原比例適合。

12、通過對聯(lián)合疫苗、單價疫苗小鼠抗體亞類比較分析得出,聯(lián)合疫苗和單價疫苗誘導(dǎo)產(chǎn)生的特異抗體IgG均以IgG1為主,疫苗誘導(dǎo)小鼠產(chǎn)生的免疫應(yīng)答以體液免疫為主,聯(lián)合疫苗中各抗原組分并沒有改變小鼠免疫應(yīng)答的格局。 綜上所述,成功制備了實驗性甲肝-乙肝-戊肝聯(lián)合疫苗,觀察了其免疫原性,并分析了聯(lián)合疫苗中三種抗原的相互作用,探討了疫苗誘導(dǎo)免疫應(yīng)答的類型。通過統(tǒng)計分析得出當(dāng)該聯(lián)合疫苗中抗原組分濃度合適時聯(lián)合疫苗誘導(dǎo)小鼠產(chǎn)生的抗體水平不低于同劑量