共表達(dá)γ干擾素的豬細(xì)小病毒與豬乙型腦炎病毒核酸疫苗的構(gòu)建及其免疫原性研究.pdf

1、本實(shí)驗(yàn)為構(gòu)建和篩選良好的豬乙型腦炎和豬細(xì)小病毒的核酸疫苗，并提高核酸疫苗的免疫效果，用重疊PCR法把PPVVP2和JEV E10連接起來，得到重組質(zhì)粒pcDNA.VE，再設(shè)計(jì)一對(duì)特異性引物擴(kuò)增IFN-γ并插入載體pcDNA.VE，構(gòu)建含有PPV VP2基因、JEV E10基因和IFN-γ基因的重組質(zhì)粒pcDNA.VEI，并使其共同表達(dá)。用脂質(zhì)體將pcDNA.VEI介導(dǎo)入Vero細(xì)胞，通過間接免疫熒光法檢測(cè)目的基因的體外表達(dá)，觀察細(xì)胞綠色

2、熒光。用pcDNA.VEI和不表達(dá)IFN-γ的pcDNA.VE分別免疫Balb/c小鼠，同時(shí)設(shè)立PBS、豬細(xì)小病毒滅活疫苗、乙型腦炎弱毒疫苗和pcDNA3.1空白質(zhì)粒免疫對(duì)照組。共免疫兩次，間隔2周檢測(cè)免疫指標(biāo)。觀測(cè)脾淋巴細(xì)胞增殖、通過ELISA觀測(cè)免疫小鼠的抗體水平，并進(jìn)行T細(xì)胞亞群動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)。
　　 結(jié)果顯示，通過鑒定核酸疫苗的構(gòu)建達(dá)到了預(yù)期目標(biāo)，并可在熒光顯微鏡下觀察到了其轉(zhuǎn)染的Vero細(xì)胞。該核酸疫苗能夠誘導(dǎo)脾淋巴細(xì)胞增殖

3、。ELISA結(jié)果顯示，與pcDNA.VE和陰性對(duì)照組進(jìn)行比較，pcDNA.VEI所誘導(dǎo)產(chǎn)生的兩種抗體都較高。在首免后2周時(shí)還不明顯，但隨后抗體水平逐漸增高，第4周時(shí)抗體水平顯示出明顯增高。pcDNA.VEI組能較穩(wěn)定的誘導(dǎo)產(chǎn)生T細(xì)胞亞群，并檢測(cè)到CD4+/CD8+比例于首免2周后都高于pcDNA.VE。結(jié)果表明：共表達(dá)γ干擾素的乙型腦炎病毒與豬細(xì)小病毒核酸疫苗構(gòu)建成功，并能產(chǎn)生特異誘導(dǎo)體液免疫和細(xì)胞免疫，在小鼠免疫試驗(yàn)中IFNγ基因在核