豬細小病毒病—豬圓環(huán)病毒病二聯(lián)滅活疫苗的研究.pdf

1、豬細小病毒病(Porcine parvovirus disease)和豬圓環(huán)病毒病(Porcine circovirus disease)均是危害世界養(yǎng)豬業(yè)的重大疫病，分別是由豬細小病毒(Porcine parvovirus，PPV)和豬圓環(huán)病毒2型(Porcine circovirus type2，PCV2)感染引起的，這兩種疾病廣泛存在于世界各地并在大多數(shù)種豬場流行，嚴重影響著養(yǎng)豬業(yè)的發(fā)展。目前，疫苗接種是有效防控這兩種重要傳染病的

2、主要措施，但是僅用單苗費時費力、應(yīng)激大，存在免疫漏洞，人們迫切需要“一針防兩病”的高效二聯(lián)滅活疫苗，鑒于此，本研究經(jīng)過免疫原性試驗、免疫保護性試驗等最終篩選出1株P(guān)CV2疫苗候選株。為了克服PCV2體外繁殖能力差，增殖滴度低的缺點，并初步探討利用轉(zhuǎn)管微載體培養(yǎng)PK-15細胞生產(chǎn)PCV2，在此基礎(chǔ)上聯(lián)合實驗室前期已經(jīng)篩選到的PPV疫苗候選株HNZK株成功制備出豬細小病毒病和豬圓環(huán)病毒病二聯(lián)滅活疫苗，主要研究內(nèi)容如下:
　　1、為篩選

3、出滿足PCV2滅活疫苗制苗要求的毒株，選擇本實驗室分離保存的8株P(guān)CV2分離株進行免疫原性分析。結(jié)果顯示，8株P(guān)CV2分離株中HNTP和HNYY分離株病毒培養(yǎng)原液制備的滅活疫苗免疫小鼠后誘導(dǎo)產(chǎn)生的抗體水平較高，二免后一周抗體水平即高于1∶800，達到PCV2滅活疫苗的國家質(zhì)量標準要求，三周時達到峰值1∶3200，比對照商品疫苗誘導(dǎo)產(chǎn)生的抗體水平(1∶1600)更高;其分別稀釋130倍和463倍后制備的疫苗誘導(dǎo)產(chǎn)生的抗體水平在二免后三周也

4、能達到1∶800。由以上結(jié)果可知，PCV2 HNTP和HNYY分離株毒價高，免疫效力良好，是理想的疫苗候選株。本研究豐富了PCV2滅活疫苗毒株的種毒資源，為研制高質(zhì)量的PCV2疫苗奠定了基礎(chǔ)。
　　2、為了研究PCV2疫苗候選株（HNTP和HNYY株）制備的疫苗的免疫保護作用，對二免四周后的小鼠分別攻不同劑量的PCV2，通過臨床癥狀觀察和小鼠組織中病毒載量檢測，來評價本研究所制備疫苗對不同劑量攻毒的保護作用。結(jié)果顯示，免疫組小鼠組

5、織中各攻毒組中均未檢測到病毒，說明疫苗起到了保護作用，且HNYY株制備疫苗產(chǎn)生的抗體持續(xù)時間長，因此后期疫苗制備選用HNYY株。對照組中接受6.072×106copies，6.072×107copies攻毒劑量的小鼠組織中均檢測到病毒，說明病毒在小鼠體內(nèi)復(fù)制，并在心、肝、肺、淋巴結(jié)中病毒含量相對較高。
　　3、為了克服PCV2體外繁殖能力差，增殖滴度低的缺點，作者利用微載體貼壁細胞具有高比表面積、細胞產(chǎn)量高、便于監(jiān)測、控制和取樣，

6、生產(chǎn)規(guī)模容易放大，不易污染等優(yōu)點，初步探討利用轉(zhuǎn)管微載體培養(yǎng)PK-15細胞生產(chǎn)PCV2。結(jié)果顯示，相同培養(yǎng)液中轉(zhuǎn)管培養(yǎng)PK-15細胞數(shù)是普通方瓶培養(yǎng)細胞數(shù)的10倍左右，接毒120.8MOI組在接毒后100h時病毒含量基本達到最高5.53E+06copies/μL，可以提高病毒滴度1.65倍左右。以上結(jié)果說明利用微載體培養(yǎng)PK-15細胞生產(chǎn)PCV2是可行的，為提高病毒增殖滴度和大規(guī)模工業(yè)化生產(chǎn)高效價疫苗抗原提供了技術(shù)依據(jù)。
　　4、

7、利用篩選出的PCV2 HNYY毒株和實驗室分離鑒定的PPV HNZK株分別制備病毒液，經(jīng)透析袋濃縮法制備高滴度的兩種病毒液作為制備二聯(lián)滅活疫苗的抗原，收集病毒液進行甲醛滅活，將上述兩種滅活病毒液等體積混合后加入油佐劑乳化制成豬細小病毒病-豬圓環(huán)病毒病二聯(lián)滅活疫苗，并在進行了疫苗的物理性狀、無菌檢驗后，進行了安全性及動物免疫試驗。結(jié)果顯示，該二聯(lián)滅活疫苗對動物安全可靠，免疫小鼠后，二聯(lián)疫苗于二免后二周PCV2ELISA抗體水平達到高峰(1