糖皮質(zhì)激素增強(qiáng)人卵巢癌細(xì)胞對(duì)化療藥物抵抗及其機(jī)制的研究.pdf

1、卵巢癌是婦科腫瘤死亡率最高的腫瘤，因其早期癥狀不明顯，待到腫瘤發(fā)現(xiàn)時(shí)大部分已經(jīng)是晚期，而且卵巢癌易于轉(zhuǎn)移，即便是能早期發(fā)現(xiàn)行手術(shù)治療，治療后也需輔以化療，因此大部分的卵巢癌患者都需要接受化療。人工合成的糖皮質(zhì)激素(GC)如地塞米松(Dex)因其能夠減輕化療所導(dǎo)致的惡心、嘔吐以及組織水腫等毒副作用而作為化療方案中的輔助用藥常規(guī)應(yīng)用于卵巢癌的治療中。然而，近年來(lái)陸續(xù)有報(bào)道表明，GC能夠抑制多種腫瘤細(xì)胞的凋亡作用，如GC在乳腺癌、肺癌、前列腺

2、癌、宮頸癌和卵巢癌等細(xì)胞系中，能明顯抑制由化療藥物誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡，這些化療藥物包括順鉑、紫杉醇、5-Fu、阿霉素和放線菌素D。在其他一些上皮來(lái)源的腫瘤如神經(jīng)膠質(zhì)瘤以及神經(jīng)纖維肉瘤等細(xì)胞中這種現(xiàn)象也被證實(shí)。ZhangC等在體內(nèi)和體外實(shí)驗(yàn)中均證實(shí)GC處理胰腺癌細(xì)胞將誘導(dǎo)化療耐藥。但是關(guān)于糖皮質(zhì)激素抵抗化療的具體機(jī)制目前尚不很清楚。本實(shí)驗(yàn)旨在卵巢癌細(xì)胞系HO-8910和SKOV3中探討Dex是否抵抗化療藥物順鉑和紫杉醇對(duì)卵巢癌的凋亡作用以及其

3、可能的機(jī)制。本課題首先檢測(cè)了順鉑、紫杉醇兩種化療藥單獨(dú)及聯(lián)合Dex對(duì)卵巢癌HO-8910和SKOV3細(xì)胞存活的影響。結(jié)果表明，順鉑和紫杉醇單獨(dú)作用能顯著的以濃度依賴性的方式降低細(xì)胞的存活，但兩者合用存活的細(xì)胞數(shù)卻較單獨(dú)順鉑組明顯增加。
　　 本校病理生理學(xué)教研室之前的研究發(fā)現(xiàn)，用Dex處理HO-8910細(xì)胞和用無(wú)水乙醇處理細(xì)胞相比，胰酶消化細(xì)胞所需時(shí)間顯著延長(zhǎng)。分別用100nMDex和無(wú)水乙醇處理HO-8910細(xì)胞24小時(shí)后，用

4、0.25％胰酶消化，所需的消化時(shí)間各自為16±3.5min、4±0.5min。在另一株卵巢癌細(xì)胞系SKOV3中也發(fā)現(xiàn)同樣的現(xiàn)象。說(shuō)明Dex可能增強(qiáng)了細(xì)胞與細(xì)胞外基質(zhì)之間的粘附能力。為此我們進(jìn)一步研究了Dex對(duì)細(xì)胞粘附能力的影響。
　　 我們用整合素β1的中和抗體來(lái)處理細(xì)胞，觀察Dex對(duì)細(xì)胞粘附能力的調(diào)節(jié)作用是否受到影響。CD44也是參與介導(dǎo)細(xì)胞與細(xì)胞外基質(zhì)之間的粘附作用的重要粘附分子。因此我們進(jìn)一步用CD44的中和抗體來(lái)阻斷CD

5、44的信號(hào)通路，觀察Dex是否通過(guò)CD44增加HO-8910細(xì)胞與細(xì)胞外基質(zhì)的粘附。結(jié)果表明Dex是通過(guò)細(xì)胞表面粘附分子的受體增強(qiáng)HO-8910與細(xì)胞外基質(zhì)的粘附能力。
　　 整合素與細(xì)胞外基質(zhì)結(jié)合后，能通過(guò)激活FAK，進(jìn)一步激活下游的多條信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路。PI-3K-AKT通路是FAK下游的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路之一。既往的研究表明PI-3K-AKT活化后能保護(hù)多種細(xì)胞，如上皮細(xì)胞、成纖維細(xì)胞等免于因紫外線照射、去除培養(yǎng)液中的血清或生長(zhǎng)因子

6、以及使貼壁培養(yǎng)的上皮細(xì)胞被懸浮等所誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡。因此我們首先觀察了Dex對(duì)FAK活性的影響。我們進(jìn)一步檢測(cè)了PI-3K下游的AKT的磷酸化水平。并使用AKT的抑制劑wortmanin觀察其是否能阻斷Dex促進(jìn)細(xì)胞存活和抗化療藥誘導(dǎo)的凋亡作用。以上結(jié)果表明PI-3K/AKT通路介導(dǎo)了Dex對(duì)紫杉醇誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡的保護(hù)作用。
　　 本校病理生理教研室之前的研究發(fā)現(xiàn)，Dex能明顯增強(qiáng)卵巢癌HO-8910細(xì)胞和SKOV3細(xì)胞與瓶壁的粘

7、附能力。這種作用與Dex上調(diào)整合素家族粘附分子的表達(dá)有關(guān)。但是Dex是否影響卵巢癌細(xì)胞ECM成分的表達(dá)和分泌還不清楚。Dex增加細(xì)胞粘附后，通過(guò)激活哪些下游信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路介導(dǎo)Dex抵抗化療藥誘導(dǎo)凋亡的作用也不清楚。本研究在之前研究的基礎(chǔ)上，進(jìn)一步研究了Dex促進(jìn)卵巢癌細(xì)胞粘附的機(jī)制和促進(jìn)卵巢癌細(xì)胞在化療藥作用的存活和抗凋亡的機(jī)制。本研究不僅有助于進(jìn)一步闡明GC對(duì)卵巢癌細(xì)胞增強(qiáng)粘附和促存活抗凋亡的作用機(jī)制，還可為臨床合理使用化療藥提供理論依

8、據(jù)。
　　 第一部分，地塞米松增強(qiáng)人卵巢癌細(xì)胞對(duì)化療藥物的抵抗
　　 目的：探討Dex是否抵抗化療藥物順鉑和紫杉醇對(duì)卵巢癌細(xì)胞(HO-8910、SKOV3)的凋亡作用。
　　 方法：首先用MTT法檢測(cè)了不同濃度順鉑、紫杉醇兩種化療藥物單獨(dú)及聯(lián)合Dex對(duì)卵巢癌HO-8910和SKOV3細(xì)胞存活的影響；用AnnexinV-FITC單染法，流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡；用Westernblotting的方法進(jìn)一步檢測(cè)了活化形

9、式caspase-3蛋白的表達(dá)情況；進(jìn)一步研究了Dex對(duì)卵巢癌細(xì)胞與細(xì)胞外基質(zhì)粘附能力的影響。
　　 結(jié)果：(1)順鉑單獨(dú)作用能顯著的以濃度依賴性的方式降低細(xì)胞的存活，Dex單獨(dú)作用也能抑制上述細(xì)胞的增殖，但兩者合用存活的細(xì)胞數(shù)卻較單獨(dú)順鉑組明顯增加。另外的一種用于卵巢癌治療的化療藥物紫杉醇與Dex聯(lián)用也能使HO-8910和SKOV3細(xì)胞系存活的細(xì)胞數(shù)較單用紫杉醇組明顯增多。(2)流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡，結(jié)果發(fā)現(xiàn)2μg/ml順鉑

10、處理HO-8910細(xì)胞，凋亡細(xì)胞數(shù)約占總細(xì)胞數(shù)的18.38％(P＜0.05)，順鉑聯(lián)合Dex處理組，其凋亡細(xì)胞數(shù)下降到總細(xì)胞數(shù)的10.1％(P＜0.01)。(3)在HO-8910細(xì)胞中，順鉑能顯著誘導(dǎo)活化的caspase-3的表達(dá)，而Dex能夠明顯抑制順鉑對(duì)活化的caspase-3表達(dá)的誘導(dǎo)作用。證明了Dex是通過(guò)抑制了化療藥物對(duì)HO-8910細(xì)胞的促凋亡作用來(lái)增強(qiáng)細(xì)胞的活性的。(4)Dex能夠以時(shí)間依賴的方式顯著增強(qiáng)HO-8910和S

11、KOV3細(xì)胞在FN包被的培養(yǎng)板中的粘附能力。
　　 結(jié)論：Dex能減輕化療藥物對(duì)卵巢癌細(xì)胞的殺傷作用。Dex是通過(guò)抑制了化療藥物對(duì)HO-8910細(xì)胞的促凋亡作用來(lái)增強(qiáng)細(xì)胞的活性的。Dex增強(qiáng)了卵巢癌細(xì)胞與細(xì)胞外基質(zhì)的粘附能力。
　　 第二部分，地塞米松增強(qiáng)人卵巢癌細(xì)胞對(duì)化療藥物抵抗機(jī)制的研究
　　 目的：探討地塞米松增強(qiáng)人卵巢癌細(xì)胞對(duì)化療藥物抵抗機(jī)制的研究。
　　 方法：設(shè)計(jì)用Dex處理不同時(shí)間點(diǎn)對(duì)HO-

12、8910細(xì)胞ECM成分表達(dá)與分泌的影響。100nMDex處理HO-8910細(xì)胞0～48h，realtime-PCR檢測(cè)mRNA的表達(dá)，ELISA檢測(cè)蛋白的分泌；整合素β1的中和抗體處理細(xì)胞后，用MTT法檢測(cè)了Dex促進(jìn)細(xì)胞存活和抗化療藥誘導(dǎo)的凋亡作用的影響；我們用WesternBlot的方法檢測(cè)了Dex對(duì)FAK磷酸化水平的影響；進(jìn)一步檢測(cè)了PI-3K下游的AKT的磷酸化水平；使用AKT的抑制劑wortmanin觀察其是否能阻斷Dex促進(jìn)

13、細(xì)胞存活和抗化療藥誘導(dǎo)的凋亡作用。
　　 結(jié)果：(1)Dex處理組細(xì)胞與對(duì)照細(xì)胞相比，Ⅰ型、Ⅲ型和Ⅳ型膠原和層粘連蛋白mRNA的表達(dá)無(wú)明顯差別，層粘連蛋白和透明質(zhì)酸的分泌也無(wú)明顯改變。纖連蛋白mRNA的表達(dá)略上調(diào)，約為對(duì)照的1.72倍。以上結(jié)果表明在HO-8910細(xì)胞中，Dex增強(qiáng)細(xì)胞粘附作用可能并非通過(guò)改變細(xì)胞外基質(zhì)的成分來(lái)實(shí)現(xiàn)的。(2)整合素β1中和抗體能夠部分阻斷Dex所誘導(dǎo)的細(xì)胞與基質(zhì)問(wèn)的粘附，且隨著中和抗體濃度的增高阻

14、斷作用更強(qiáng)。20μg/ml的整合素β1中和抗體可以使粘附的細(xì)胞數(shù)比Dex單獨(dú)處理組降低27.3％(p＜0.05)。這個(gè)結(jié)果表明整合素β1亞族介導(dǎo)了Dex對(duì)HO-8910細(xì)胞粘附能力的增強(qiáng)作用。(3)進(jìn)一步觀察了整合素β1的中和抗體處理細(xì)胞后，Dex促進(jìn)細(xì)胞存活和抗化療藥誘導(dǎo)的凋亡作用的影響，結(jié)果顯示，整合素β1中和抗體能夠降低Dex對(duì)順鉑誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡的保護(hù)作用。20μg/ml的整合素β1中和抗體可以減低Dex對(duì)順鉑的保護(hù)作用，使存活的

15、細(xì)胞數(shù)為Dex單獨(dú)處理組的61.5％(p＜0.05)。(4)CD44中和抗體能夠部分阻斷Dex所誘導(dǎo)的細(xì)胞與FN之間的粘附，且隨著中和抗體濃度的增高阻斷作用更強(qiáng)。40μg/ml的CD44中和抗體可以使Dex處理組粘附的細(xì)胞數(shù)比單獨(dú)Dex處理組降低26.5％(p＜0.05)。(5)100nMDex處理HO-8910細(xì)胞20min，細(xì)胞中FAK的磷酸化水平即開始增高，40min時(shí)達(dá)最高峰，60min時(shí)回落至對(duì)照水平，總的FAK蛋白表達(dá)水平無(wú)

16、明顯變化，表明Dex可以快速激活FAK。在SKOV3細(xì)胞中100nMDex處理細(xì)胞10min，細(xì)胞中FAK的磷酸化水平即開始增高，60min時(shí)達(dá)最高峰。(6)100nMDex處理細(xì)胞0～36h，westernblotting結(jié)果顯示，Dex能使HO-8910和SKOV3細(xì)胞中磷酸化的AKT蛋白明顯增多，100nMDex處理HO-8910細(xì)胞8h，細(xì)胞中AKT的磷酸化水平即開始增高，12小時(shí)達(dá)高峰，持續(xù)到36小時(shí)仍然無(wú)明顯降低，總的AKT

17、蛋白表達(dá)水平無(wú)明顯變化，表明Dex可以激活A(yù)KT。相似的結(jié)果也在SKOV3細(xì)胞中得到證實(shí)。(7)使用AKT的抑制劑wortmanin觀察其是否能阻斷Dex促進(jìn)細(xì)胞存活和抗化療藥誘導(dǎo)的凋亡作用。100nMDex具有保護(hù)細(xì)胞抗紫杉醇誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的作用，使得存活細(xì)胞數(shù)較單獨(dú)紫杉醇組增加約50％，而PI-3K/AKT抑制劑wortmanin能夠逆轉(zhuǎn)Dex的此種保護(hù)作用，使得存活細(xì)胞數(shù)回到單用紫杉醇的水平
　　 結(jié)論：在HO-8910細(xì)胞