糖皮質(zhì)激素誘導人卵巢癌細胞系HO-8910骨架重組的作用及其可能的分子機制.pdf

1、糖皮質(zhì)激素(glucocorticoids，GCs)能通過基因組和非基因組機制調(diào)節(jié)細胞的生長、分化、凋亡和粘附等，但是作用機制還沒有完全闡明。真核細胞的空間結(jié)構(gòu)由細胞骨架(cytoskeleton)維持，細胞骨架在胚胎發(fā)育、傷口愈合以及腫瘤發(fā)生等生理和病理過程中發(fā)揮重要作用。多種細胞外信號，包括趨化因子、激素、生長因子等通過細胞膜受體以及細胞粘附分子(如整合素)等，激活細胞內(nèi)的多條信號轉(zhuǎn)導通路，導致細胞骨架重組，從而調(diào)節(jié)細胞的粘附、運動

2、、生長和凋亡等。 我們實驗室的前期工作發(fā)現(xiàn)，人工合成的糖皮質(zhì)激素—地塞米松(dexamethasone,Dex)可以誘導人卵巢癌HO-8910細胞形態(tài)改變(由上皮樣變?yōu)槌衫w維樣)，并增強細胞與細胞外基質(zhì)間的粘附能力，但其作用機制卻不是很清楚。本研究擬進一步探討Dex對HO-8910細胞骨架的調(diào)節(jié)作用及其可能的分子機制。 我們首先用羅丹明-鬼筆環(huán)肽(Rhodamine-phalloidin)做細胞骨架肌動蛋白(actin)

3、染色，共聚焦顯微鏡觀察Dex處理不同時間對HO-8910細胞骨架的影響。結(jié)果顯示，未經(jīng)Dex處理的細胞骨架aetin主要分布在細胞膜下，形成一個染色環(huán)，10nMDex可誘導細胞骨架actin重組，表現(xiàn)為早期應力纖維的形成(2～8小時)，后期(12小時)應力纖維的解聚，actin在胞漿均勻分布，并重新向膜周聚集的動態(tài)過程。 粘附斑激酶(focaladhesionkinase，F(xiàn)AK)與粘附斑和應力纖維的形成有關。我們用磷酸化FAK

4、的抗體，用Westernblots的方法證實Dex能夠快速(20min)增加磷酸化FAK的水平，表明Dex可以通過非基因組機制快速激活FAK，提示FAK的激活與Dex早期誘導HO-8910細胞骨架actin形成應力纖維密切相關。 小G蛋白Rho家族(Rho、Rac和Cdc42等)是細胞骨架調(diào)節(jié)的關鍵因子。它們的激活能促進應力纖維和偽足的形成。RhoB是Rho亞族的成員，我們前期的工作表明，Dex能夠以濃度和時間依賴性的方式誘導R

5、hoB的表達。因此我們進一步觀察了RhoB表達的改變與Dex誘導的HO-8910細胞骨架actin重組的關系。結(jié)果發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)染野生型RhoB表達載體(RhoB-wt)的細胞骨架actin主要在胞漿彌散分布，用10nMDex處理上述細胞，actin在胞漿彌散分布更加明顯，瞬轉(zhuǎn)RhoB的RNA干擾質(zhì)粒表達載體(RhoB-RNAi)對細胞骨架actin沒有明顯影響，用10nMDex處理瞬轉(zhuǎn)RhoB-RNAi的細胞24小時后，可見胞漿有部分應力纖維

6、的形成。上述結(jié)果表明Dex對RhoB的誘導參與了Dex對HO-8910細胞骨架actin重組的調(diào)節(jié)，其作用可能與Dex處理后期應力纖維發(fā)生解聚有關。 Rho相關激酶Ⅱ(ROCKⅡ)是Rho下游的效應蛋白，在細胞骨架的重組中發(fā)揮著重要的作用，與應力纖維的形成有關。我們用RT-PCR和Westernblots方法分別檢測Dex對HO-8910細胞的mRNA和蛋白表達的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)Dex能夠以濃度和時間依賴的方式上調(diào)ROCKⅡmRN

7、A和蛋白的表達。我們進一步用ROCK特異阻斷劑Y-27632研究了該酶在Dex誘導的細胞骨架actin重組中可能的作用，結(jié)果發(fā)現(xiàn)10μMY-27632能夠逆轉(zhuǎn)Dex對HO-8910細胞骨架actin的改變。提示ROCK信號蛋白參與了Dex對HO-8910細胞骨架重組的調(diào)節(jié)。 最后，我們探討了Dex、RhoB與轉(zhuǎn)錄因子NF-κB活性的關系，以及NF-κB在Dex誘導的細胞骨架actin重組方面可能的作用。我們用報告基因(pGL3-

8、NF-κB-luc)檢測NF-κB的轉(zhuǎn)錄活性，發(fā)現(xiàn)生理濃度的Dex能夠上調(diào)NF-κB的轉(zhuǎn)錄活性，RhoB過表達或RhoB激活也能使NF-κB的核轉(zhuǎn)位增加，基礎轉(zhuǎn)錄活性增強。而用RNA干擾技術或RhoB顯性失活突變體阻斷RhoB的表達或抑制其活性，NF-κB的轉(zhuǎn)錄活性則不增加。這些結(jié)果表明在HO-8910細胞中，RhoB能夠上調(diào)NF-κB的轉(zhuǎn)錄活性，因此推測Dex增強NF-κB的轉(zhuǎn)錄活性可能至少部分是通過誘導RhoB的表達來實現(xiàn)的。

9、 轉(zhuǎn)錄因子NF-κB與細胞骨架關系雖有研究報道，但并沒有闡明。為此我們用NF-κB的阻斷劑PDTC進一步觀察了NF-κB在Dex誘導細胞骨架重組中的可能作用。結(jié)果發(fā)現(xiàn)5μM的PDTC可以逆轉(zhuǎn)Dex對HO-8910細胞骨架的重組。上述結(jié)果也提示NF-κB可能參與了Dex對HO-8910細胞骨架的調(diào)節(jié)。我們實驗室以往的工作表明，Dex能夠拮抗順鉑誘導的HO-8910細胞的凋亡，因此我們認為Dex增加細胞粘附，上調(diào)NF-κB的轉(zhuǎn)錄活性可能是

10、Dex保護細胞免于凋亡的機制之一。 綜上所述，我們發(fā)現(xiàn)Dex能夠誘導HO-8910細胞骨架actin重組，表現(xiàn)為actin從膜周到胞漿分布的改變以及應力纖維的形成與解聚。Dex快速激活FAK可能是Dex誘導細胞早期應力纖維形成的機制之一。Dex能夠誘導RhoB及其下游蛋白ROCKⅡ的表達，RhoB-ROCKⅡ信號轉(zhuǎn)導通路可能參與了骨架actin重組的調(diào)節(jié)。Dex能增強NF-κB的轉(zhuǎn)錄活性，該作用至少部分與誘導RhoB表達增多有關