糖皮質(zhì)激素抵抗的分子機(jī)制研究——糖皮質(zhì)激素受體啟動(dòng)子在激素反應(yīng)性中的作用.pdf

1、研究背景：神經(jīng)內(nèi)分泌免疫學(xué)是指人體神經(jīng)系統(tǒng)、內(nèi)分泌系統(tǒng)和免疫系統(tǒng)存在動(dòng)態(tài)的相互聯(lián)系，從整體水平上對(duì)機(jī)體做出調(diào)節(jié)，使機(jī)體對(duì)內(nèi)在或者外來(lái)的應(yīng)激因素做出反應(yīng)，在維持機(jī)體內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)定中起到重要作用。其中下丘腦-垂體-腎上腺軸(Hypothalamic-pituitary-adrenal，HPA)是神經(jīng)內(nèi)分泌免疫網(wǎng)絡(luò)最重要的一個(gè)調(diào)節(jié)通路。糖皮質(zhì)激素(Glucocorticoids，GC)是HPA軸的關(guān)鍵性分子，在神經(jīng)內(nèi)分泌免疫網(wǎng)絡(luò)的對(duì)話中起著很重

2、要的溝通作用。在人體內(nèi)，GC對(duì)免疫系統(tǒng)有著全面的調(diào)節(jié)性作用。這是使用外源性GC治療很多免疫相關(guān)性疾病的一個(gè)重要理論基礎(chǔ)。而越來(lái)越多的證據(jù)表明，臨床上免疫性疾病的發(fā)生發(fā)展是免疫調(diào)節(jié)不平衡的結(jié)果，過(guò)去所有的治療都集中在如何單方面抑制免疫系統(tǒng)的活動(dòng)，而不去注意機(jī)體內(nèi)在免疫調(diào)節(jié)的機(jī)制——神經(jīng)內(nèi)分泌免疫調(diào)節(jié)網(wǎng)絡(luò)，所以到目前為止，免疫性疾病的治療仍然沒(méi)有突破性進(jìn)展。神經(jīng)內(nèi)分泌免疫調(diào)節(jié)作用的重要靶細(xì)胞是人體免疫功能主要的執(zhí)行者——外周血單個(gè)核細(xì)胞(P

3、eripheral bloodmononuclear cells，PBMCs)。PBMCs對(duì)GC的反應(yīng)性，存在很大的個(gè)體差異。對(duì)GC的反應(yīng)性低下不單使外源性GC的治療不能達(dá)到預(yù)期的效果，也使機(jī)體內(nèi)源性的GC不能完全發(fā)揮其免疫調(diào)節(jié)作用，成為免疫相關(guān)性疾病的發(fā)生發(fā)展的一個(gè)重要誘因。GC效應(yīng)的發(fā)揮主要通過(guò)其受體——糖皮質(zhì)激素受體(Glucocorticoid receptor，GR)實(shí)現(xiàn)。研究發(fā)現(xiàn)，GR基因的啟動(dòng)子區(qū)存在多個(gè)啟動(dòng)子，均能獨(dú)立啟

4、動(dòng)GR的轉(zhuǎn)錄和翻譯。不同啟動(dòng)子的使用會(huì)影響GR轉(zhuǎn)錄和翻譯的結(jié)果，形成多種mRNA和蛋白質(zhì)亞型。而多種GR亞型的存在，可能是GC反應(yīng)多樣化的一個(gè)重要分子基礎(chǔ)。GR的啟動(dòng)子上還存在多個(gè)順式作用元件，反式作用因子如轉(zhuǎn)錄因子可以與其結(jié)合調(diào)節(jié)GR的表達(dá)?；罨腉R本身就可以和GR的啟動(dòng)子區(qū)結(jié)合，實(shí)現(xiàn)對(duì)自身表達(dá)的調(diào)控。因此GR啟動(dòng)子區(qū)對(duì)GC的反應(yīng)性可能起著重要的調(diào)節(jié)作用。然而，目前對(duì)GR啟動(dòng)子在GC抵抗中的作用尚有爭(zhēng)議，大部分的報(bào)道是來(lái)自于血液系統(tǒng)

5、的惡性腫瘤。
　　 目的：以PBMCs和原發(fā)性腎病綜合征為研究目標(biāo)，探討GR啟動(dòng)子的使用對(duì)GC反應(yīng)性的影響。在PBMCs中，GR啟動(dòng)子的使用和亞型的表達(dá)情況以及兩者的關(guān)系；PBMCs中是否存在和啟動(dòng)子使用相關(guān)的GR自我調(diào)節(jié)機(jī)制。；原發(fā)性腎病綜合征患者激素抵抗的現(xiàn)象是否和上述機(jī)制存在聯(lián)系。
　　 方法：⑴采用半定量RT-PCR方法檢測(cè)PBMCs中GR啟動(dòng)子的使用和亞型的表達(dá)情況，并與人體其他細(xì)胞(HepG2，HK-2)進(jìn)行

6、對(duì)比。對(duì)PBMCs中GR各個(gè)第一外顯子(exon1s)和亞型的相對(duì)表達(dá)量進(jìn)行相關(guān)性分析。⑵使用RT-PCR及western-blot檢測(cè)在GC刺激下，PBMCs中exon1A和GR表達(dá)的變化，再進(jìn)一步使用Real-time PCR對(duì)GC刺激下PBMCs中GR exon1s和亞型的表達(dá)情況進(jìn)行精確的測(cè)定。⑶使用Real-timePCR測(cè)定對(duì)激素反應(yīng)性不同的INS患者GRexon1s和亞型的表達(dá)情況，并進(jìn)行對(duì)比。western-blot檢測(cè)

7、兩者病人GR蛋白表達(dá)上的差異。
　　 結(jié)果：①在PBMCs、HepG2、HK-2三種細(xì)胞中，均表達(dá)GR exon1C，exon1B，GR-α，GR-P。而exon1A特異性表達(dá)于PBMCs中。PBMCs中GR功能性亞型GR-α的表達(dá)量和exon1C以及exon1A都有密切的相關(guān)，而另一亞型GR-P的表達(dá)和exon1B相關(guān)。②GC的刺激可以誘導(dǎo)PBMCs中GR及GR exon1A表達(dá)的上調(diào)，上調(diào)的GR亞型主要是由exon1A啟動(dòng)轉(zhuǎn)

8、錄的GR-α。在不表達(dá)exon1A的HepG2細(xì)胞中，GC的刺激會(huì)誘導(dǎo)GR表達(dá)的下降。③在對(duì)激素反應(yīng)性不同的INS患者中，存在不同的啟動(dòng)子使用方式，激素敏感的病人以GR exon1A為主，而激素抵抗的病人以exon1C為主，但兩者在總的GR表達(dá)量上以及各個(gè)亞型的表達(dá)量上無(wú)明顯差異。
　　 結(jié)論：⑴GR的啟動(dòng)子使用方式有著組織的特異性。其中啟動(dòng)子1A只特異性的表達(dá)于PBMCs中。啟動(dòng)子1C是啟動(dòng)GR基礎(chǔ)表達(dá)主要的啟動(dòng)子。不同啟動(dòng)子

9、的使用和不同GR mRNA亞型的表達(dá)密切相關(guān)。在PBMCs中，GR-α的表達(dá)來(lái)源于啟動(dòng)子1A和1C啟動(dòng)的轉(zhuǎn)錄，而GR-P的表達(dá)來(lái)源于啟動(dòng)子1B的轉(zhuǎn)錄。⑵不同細(xì)胞對(duì)GC的刺激表現(xiàn)出不同的反應(yīng)。在HepG2細(xì)胞中，GC的刺激會(huì)引起GR生理反饋性的下降。而在PBMCs中，GC的刺激會(huì)引起GR表達(dá)的增多，上調(diào)的GR主要為功能性亞型GR-α。這種效應(yīng)有助于進(jìn)一步擴(kuò)大GC在PBMCs中的作用。啟動(dòng)子1A在GR的上調(diào)機(jī)制中起到重要的作用，因?yàn)樯险{(diào)的G