腦神康膠囊對(duì)高糖乏氧環(huán)境下大鼠海馬神經(jīng)元氧化應(yīng)激的影響.pdf

1、目的:
　　1.觀察益氣補(bǔ)腎中藥-腦神康膠囊對(duì)高糖乏氧環(huán)境下體外培養(yǎng)大鼠海馬神經(jīng)元形態(tài)學(xué)、細(xì)胞存活率和凋亡率的影響。
　　2.研究高糖乏氧環(huán)境下大鼠海馬神經(jīng)元HIF-1α、Nox4、p47phox因子的表達(dá)及探討腦神康膠囊對(duì)損傷神經(jīng)元的保護(hù)作用機(jī)制。
　　方法:
　　1.含藥血清的制備30只成年雄性Wistar大鼠隨機(jī)分為5組，每組6只，分別予黃芪顆粒溶液(10ml/kg)、腦神康低(5ml/kg)、中（10ml

2、/kg）、高劑量(20ml/kg)水溶液及等量生理鹽水灌胃，第3天末次給藥1.5h后，下腔靜脈取血制備大鼠血清。
　　2.體外培養(yǎng)神經(jīng)元細(xì)胞和神經(jīng)元微管相關(guān)蛋白(MAP-2)免疫熒光染色選取出生24h之內(nèi)的Wistar新生大鼠（雌雄不限），無(wú)菌條件下剝離頭皮及顱骨，取出完整腦組織，剝除腦膜及結(jié)締組織，鈍性分離海馬，體外培養(yǎng)大鼠海馬神經(jīng)元，并于接種的第3天加入阿糖胞苷以抑制非神經(jīng)元細(xì)胞的生長(zhǎng)。此后每3天半量換液，定時(shí)在倒置相差顯微鏡

3、下觀察細(xì)胞的形態(tài)及生長(zhǎng)情況，進(jìn)行神經(jīng)元微管相關(guān)蛋白(MAP-2)免疫熒光染色鑒定，證實(shí)所培養(yǎng)的細(xì)胞為神經(jīng)元，并確定其純度。
　　3.取體外培養(yǎng)至第8天的海馬神經(jīng)元細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn)，隨機(jī)分為以下6組:
　　(1)正常對(duì)照組:用含10％生理鹽水組血清的DMEM培養(yǎng)液（5.5mmol/L）常規(guī)換液培養(yǎng)，12h后測(cè)指標(biāo);
　　(2)高糖乏氧組:加入終濃度為1mmol/L的X和20U/L的XO產(chǎn)氧體系，作用45min，然后換無(wú)血清高

4、糖DMEM培養(yǎng)液(25mmol/L)培養(yǎng)，12h后測(cè)指標(biāo);
　　(3)黃芪組，腦神康低、中、高劑量組:分別將10％黃芪組，腦神康低、中、高劑量組的含藥血清提前加入培養(yǎng)液中作用30min，后加入X/XO體系，作用45min后換無(wú)血清高糖DMEM培養(yǎng)液(25mmol/L)培養(yǎng)，12h后測(cè)指標(biāo)。
　　4.MTT法測(cè)定細(xì)胞存活率，流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡率，采用Real-TimePCR法檢測(cè)各組海馬神經(jīng)元HIF-1α、Nox4和p47

5、phoxmRNA的表達(dá)。
　　結(jié)果:
　　1.神經(jīng)元微管相關(guān)蛋白(MAP-2)免疫熒光染色檢測(cè)結(jié)果顯示，體外培養(yǎng)的細(xì)胞確定為大鼠海馬神經(jīng)元，陽(yáng)性細(xì)胞百分率為80％-90％。在倒置相差顯微鏡下觀察細(xì)胞的一般形態(tài)，高糖乏氧損傷12h后，大鼠海馬神經(jīng)元細(xì)胞數(shù)量減少，形態(tài)損傷明顯，而腦神康高劑量組的神經(jīng)元細(xì)胞形態(tài)損傷減輕，生長(zhǎng)狀態(tài)良好。
　　2.MTT和流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)結(jié)果顯示，與正常對(duì)照組相比，高糖乏氧組神經(jīng)元存活率明顯下降，

6、凋亡率顯著升高（均P＜0.01）;與高糖乏氧組比較，黃芪組及腦神康各劑量組神經(jīng)元存活率上升，凋亡率明顯下降，其中腦神康高劑量組細(xì)胞存活率最高，凋亡率最低，具統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P＜0.05)。
　　3.Real-TimePCR測(cè)定結(jié)果表明:與正常對(duì)照組相比，高糖乏氧組HIF-1α、Nox4和p47phoxmRNA的表達(dá)明顯升高（均P＜0.01）;與高糖乏氧組相比，黃芪組及腦神康各劑量組HIF-1α、Nox4和p47phoxmRNA的表達(dá)