腦神康膠囊對高糖乏氧環(huán)境下大鼠海馬神經(jīng)元氧化應(yīng)激損傷的保護作用.pdf

1、目的:
　　研究高糖乏氧環(huán)境下體外培養(yǎng)的大鼠海馬神經(jīng)元8-OHdG、HIF-1α、ROS、VEGF因子的表達并探討腦神康膠囊對神經(jīng)元的保護作用。
　　方法:
　　1.制備含中藥血清選擇24只成年雄性Wistar大鼠，用隨機數(shù)字表法隨機分為正常對照組（0.9％氯化鈉）、腦神康低劑量組(5ml/kg)、中劑量組(10ml/kg)、高劑量組(20ml/kg)，等量灌胃給藥;每天2次，連續(xù)3天，末次給藥1h后，無菌條件下右心房

2、取血，制備含藥血清，-20℃保存?zhèn)溆谩?br>　　2.海馬神經(jīng)元原代培養(yǎng)出生24h之內(nèi)的Wistar大鼠，在75％酒精中浸泡消毒，斷頭，取出完整腦組織，無菌條件下分離出雙側(cè)海馬，剪碎，消化，過濾，離心重懸后，接種，培養(yǎng)于37℃、5％CO2的培養(yǎng)箱，并于接種后第4～6h換以含2％B27的DMEM/F12培養(yǎng)基，以后每2天半量換液，倒置相差顯微鏡觀察細胞形態(tài)。
　　3.大鼠海馬神經(jīng)元鑒定MAP-2（microtubule-associ

3、ated protein-2，微管相關(guān)蛋白）熒光染色檢測細胞爬片后第9天，經(jīng)過洗滌，固定，正常山羊血清、一抗及二抗孵育，緩沖甘油封固后，在熒光顯微鏡下觀察神經(jīng)元MAP-2表達陽性細胞，并進行顯微攝影。
　　4.制備高糖乏氧損傷模型原代細胞培養(yǎng)8天后，分組及處理如下：
　　(1)高糖乏氧組:加入終濃度為1 mmol/L的X和20U/L的XO產(chǎn)氧體系，作用45min后換無血清高糖培養(yǎng)基培養(yǎng)，12h后測指標;
　　(2)腦神

4、康低、中、高劑量組則分別將腦神康低、中、高劑量的含藥血清加入培養(yǎng)液中作用30min，后加入X/XO體系，作用45min后換無血清高糖培養(yǎng)基培養(yǎng)，12h后測指標;
　　(3)正常對照組:常規(guī)換液培養(yǎng)，12h后測指標。
　　5.酶聯(lián)免疫定量吸附實驗法(Elisa)檢測8-OHdG、ROS、HIF-1α蛋白濃度，Real-time PCR法檢測各組海馬神經(jīng)元HIF-1αmRNA、ROS mRNA、VEGFmRNA的表達。
　

5、　結(jié)果:
　　1.MAP-2鑒定海馬神經(jīng)元結(jié)果顯示:體外培養(yǎng)的細胞為大鼠海馬神經(jīng)元，陽性細胞率為85～90％。在倒置相差顯微鏡下觀察，高糖乏氧組（X/XO組）的神經(jīng)元細胞數(shù)量減少，胞體腫脹;腦神康高劑量組的神經(jīng)元細胞形態(tài)損傷減輕，生長狀態(tài)良好。
　　2.酶聯(lián)免疫定量吸附實驗法(Elisa)檢測結(jié)果顯示:與正常對照組比較，8-OHdG、ROS、HIF-1α產(chǎn)生明顯增多（P均＜0.01）;與高糖乏氧組比較，腦神康各濃度組8-OH

6、dG、ROS、HIF-1α產(chǎn)生明顯降低（P均＜0.01），以高劑量組降低最明顯。
　　3.Real-time PCR法檢測結(jié)果顯示:與正常對照組比較，HIF-1α mRNA、ROSmRNA和VEGF mRNA的表達顯著上升（P均＜0.01）;與高糖乏氧組比較，腦神康各濃度組HIF-1α mRNA、ROS mRNA和VEGF mRNA的表達明顯下降(P均＜0.05)，以高劑量組下降最明顯。
　　結(jié)論:
　　腦神康可保護高