線粒體Miro1蛋白對無鎂致癇海馬神經(jīng)元氧化應(yīng)激損傷的保護(hù)作用.pdf

1、背景與目的：
　　癲癇（epilepsy,EP）是常見的神經(jīng)系統(tǒng)疾病，目前尚未明確癲癇的具體發(fā)病機(jī)制，抗癲癇藥物不能控制疾病的進(jìn)展，終止癥狀使大腦對反復(fù)癇性發(fā)作更敏感，隨著時間的進(jìn)展這種敏感性更加嚴(yán)重，這就要求我們進(jìn)一步研究癲癇的發(fā)病機(jī)制，為癲癇治療尋找新靶點。
　　線粒體對神經(jīng)遞質(zhì)合成、鈣穩(wěn)態(tài)、氧化還原反應(yīng)、活性氧的產(chǎn)生與調(diào)節(jié)以及神經(jīng)元凋亡起關(guān)鍵作用，線粒體功能障礙導(dǎo)致癲癇發(fā)作過程中氧化應(yīng)激增加，損傷線粒體DNA，引起脂質(zhì)

2、過氧化，影響ATP利用，這些反應(yīng)對抗內(nèi)源性抗氧化機(jī)制的保護(hù)作用，導(dǎo)致神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)重組、神經(jīng)元丟失、神經(jīng)干細(xì)胞移位，最終導(dǎo)致癲癇發(fā)作，破壞這一過程對研發(fā)新型抗癲癇藥物阻止癲癇發(fā)作非常關(guān)鍵。Miro1介導(dǎo)的線粒體移動通過不斷清除受損線粒體，將正常功能線粒體運輸至作用部位，維持線粒體正常功能，對神經(jīng)元發(fā)揮保護(hù)作用。因此癲癇發(fā)作過程中Miro1介導(dǎo)的線粒體移動有可能為臨床上治療癲癇提供新思路。
　　Miro是線粒體外膜Rho GTPase家族

3、的一員，它通過適配器蛋白（如Milton蛋白）與馬達(dá)分子（如驅(qū)動蛋白Kinesin）相連接。果蠅中Milton蛋白是首先被確定的將Miro蛋白與馬達(dá)分子鏈接的適配器蛋白。線粒體通過膜受體蛋白Miro連接適配器招募馬達(dá)分子。這些馬達(dá)分子/受體/適配器復(fù)合體確保目標(biāo)線粒體的運輸，精確調(diào)節(jié)它們的分配以應(yīng)對神經(jīng)元活動的改變。最新研究表明果蠅中Miro既調(diào)節(jié)軸突中線粒體的順向運輸，也調(diào)節(jié)逆向運輸。果蠅中Miro突變損害線粒體運輸至神經(jīng)元遠(yuǎn)端區(qū)域，

4、最終導(dǎo)致軸突和突觸的線粒體消耗殆盡。
　　神經(jīng)元有絲分裂后期的細(xì)胞經(jīng)歷與機(jī)體相同的生命周期，當(dāng)機(jī)體老化或者功能紊亂時需要線粒體不斷移動至作用部位來補充能量。神經(jīng)元發(fā)生應(yīng)激反應(yīng)或完整性受到破壞時線粒體會不斷改變運動來保證神經(jīng)元的正常活性。因此調(diào)節(jié)線粒體運輸對滿足新陳代謝需求的變化、移除老化及受損線粒體、補充正常功能線粒體至神經(jīng)末梢至關(guān)重要。此次研究運用Sombati法，通過無鎂細(xì)胞外液誘導(dǎo)海馬神經(jīng)元體外癲癇模型，并構(gòu)建腺病毒真核表達(dá)

5、質(zhì)粒干預(yù) Miro1表達(dá)，通過免疫蛋白印跡等多種方法檢測ND6、MDA及GSH表達(dá)水平的變化，探討Miro1對致癇海馬神經(jīng)元氧化應(yīng)激產(chǎn)生的影響，進(jìn)一步明確能否通過調(diào)控線粒體移動發(fā)揮致癇神經(jīng)元的保護(hù)作用。
　　方法：
　　將出生24小時內(nèi)的Sprague-Dawley大鼠，斷頭后剝離雙側(cè)大腦組織，然后置于磷酸鹽緩沖液（PBS）培養(yǎng)皿中，剝離雙側(cè)海馬組織，并制成單細(xì)胞懸液接種于培養(yǎng)板中進(jìn)行原代培養(yǎng)。培養(yǎng)至14d的海馬神經(jīng)元隨機(jī)分

6、為對照組（CON）、無鎂誘導(dǎo)組(AE)、AE+對照腺病毒轉(zhuǎn)染組(AE+rAdv)、AE+靶向 Miro1基因的shRNA重組腺病毒轉(zhuǎn)染組(AE+rAd-Miro1-shRNA)。CON組與AE組分別用正常含鎂細(xì)胞外液及無鎂細(xì)胞外液培養(yǎng)3h后更換為維持液培養(yǎng)。AE+rAdv組、AE+rAd-Miro1-shRNA組于無鎂誘導(dǎo)48h前分別轉(zhuǎn)染不表達(dá)任何外源基因的對照腺病毒載體（rAdv）、靶向Miro1基因的shRNA重組腺病毒真核表達(dá)質(zhì)粒

7、（rAd-Miro1-shRNA）,并于造模24h后終止細(xì)胞培養(yǎng)，用于后續(xù)實驗。通過倒置相差顯微鏡觀察海馬神經(jīng)元特征，神經(jīng)元特異性烯醇化酶（NSE）染色鑒定海馬神經(jīng)元純度，采用Western blot法檢測細(xì)胞內(nèi)Miro1、ND6蛋白的表達(dá)，免疫熒光法檢測細(xì)胞內(nèi)ND6表達(dá)，比色法測定MDA、GSH的表達(dá)。
　　結(jié)果：
　　神經(jīng)元形態(tài)學(xué)特征倒置相差顯微鏡下觀察到培養(yǎng)至7天時海馬神經(jīng)元體積變大，胞體成錐形，樹突及軸突清晰可見，細(xì)

8、胞之間具有緊密聯(lián)系。
　　神經(jīng)元純度測定神經(jīng)元特異性烯醇化酶NSE染色鑒定，培養(yǎng)至7天時海馬神經(jīng)元純度為90％以上。
　　Miro1蛋白表達(dá)情況與CON組比較，AE組、AE+rAdv組Miro1表達(dá)升高，差異均具有統(tǒng)計學(xué)意義，P<0.05；AE+rAd-Miro1-shRNA組Miro1表達(dá)降低，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義，P<0.05。與AE組比較，AE+rAdv組Miro1表達(dá)升高，差異無統(tǒng)計學(xué)意義，P>0.05；AE+rAd-

9、Miro1-shRNA組Miro1表達(dá)降低，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義，P<0.05。
　　ND6蛋白表達(dá)情況：
　　（1）Western Blot法：與CON組比較，AE組、AE+rAdv組、AE+rAd-Miro1-shRNA組ND6表達(dá)降低，差異均具有統(tǒng)計學(xué)意義，P<0.05。與AE組比較，AE+rAdv組 ND6表達(dá)降低，差異無統(tǒng)計學(xué)意義，P>0.05；AE+rAd-Miro1-shRNA組ND6表達(dá)降低，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義

10、，P<0.05。
　?。?）免疫熒光法：免疫熒光染色顯示，細(xì)胞質(zhì)呈紅色熒光，細(xì)胞核呈藍(lán)色熒光。運用ImageProPlus（IPP）圖像處理分析軟件分析，以累積光密度IOD（integrated optical density）作為胞質(zhì)內(nèi)ND6蛋白的相對表達(dá)量，其結(jié)果與Western Blot法檢測ND6蛋白表達(dá)情況一致。
　　MDA蛋白表達(dá)情況與CON組比較， AE組、AE+rAdv組、AE+rAd-Miro1-shRNA

11、組MDA表達(dá)升高，差異均具有統(tǒng)計學(xué)意義，P<0.05。與AE組比較，AE+rAdv組 MDA表達(dá)升高，差異無統(tǒng)計學(xué)意義，P>0.05；AE+rAd-Miro1-shRNA組MDA表達(dá)升高，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義，P<0.05。GSH蛋白表達(dá)情況與CON組比較，AE組、AE+rAdv組、AE+rAd-Miro1-shRNA組GSH表達(dá)降低，差異均具有統(tǒng)計學(xué)意義，P<0.05。與AE組比較，AE+rAdv組 GSH表達(dá)降低，差異無統(tǒng)計學(xué)意義，P

12、>0.05；AE+rAd-Miro1-shRNA組GSH表達(dá)降低，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義，P<0.05。
　　結(jié)論：
　　1．致癇神經(jīng)元Miro1蛋白反應(yīng)性升高，ND6蛋白降低，MDA蛋白升高， GSH蛋白降低，提示Miro1介導(dǎo)的線粒體移動參與癲癇病理過程，致癇后海馬神經(jīng)元產(chǎn)生氧化應(yīng)激損傷。
　　2．轉(zhuǎn)染rAd-Miro1-shRNA病毒后，致癇神經(jīng)元Miro1蛋白明顯降低，ND6蛋白進(jìn)一步降低，MDA蛋白進(jìn)一步升高，G