豬圓環(huán)病毒DNA競爭定量PCR檢測方法的建立及初步應(yīng)用.pdf_第1頁
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文檔簡介

1、該研究根據(jù)已發(fā)表的豬圓環(huán)病毒PCV-1和PCV-2的全基因序列,利用DNAstar軟件對PCV-1和PCV-2的全基因序列進行同源性比較,應(yīng)用Oligo6.0軟件設(shè)計出兩對引物,其中一對PCV特異性引物P1和P2,擴增出PCV-1和PCV-2上長938bp的片段;另一對為PCV-2型特異性引物P3和P4,擴增片段長490bp.復(fù)合PCR方法可以檢測到1ng的病毒核酸樣品.建立了定量檢測豬圓環(huán)病毒DNA的競爭PCR方法.PCR擴增PCV-

2、2 ORF2上490bp片段P3P4,構(gòu)建了目標(biāo)模板.將P3P4片段應(yīng)用BanⅡ酶切,再進行連接,之后克隆到pMD 18-T載體,構(gòu)建含694bp的c-P3P4 DNA片段的競爭模板,其攜帶同目標(biāo)DNA和樣本DNA相同的引物結(jié)合區(qū).以定量的競爭模板同一系列稀釋的競爭模板進行競爭PCR擴增,結(jié)果當(dāng)反應(yīng)體系中起始模板的量為1.0×10<'7>copies/ml,循環(huán)次數(shù)小于或等于30時,原始模板數(shù)以指數(shù)增長.以獲得目標(biāo)模板濃度和擴增產(chǎn)物的熒

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