組織型纖溶酶原激活劑（t-PA）突變體乳腺特異性表達(dá)載體的構(gòu)建及其細(xì)胞表達(dá)研究.pdf

1、組織型纖溶酶原激活劑(tissue-type plasminogen activator，t-PA)是治療血栓性疾病的重要藥物。自1980年首次證實(shí)t-PA具有高效特異性的溶栓作用以來(lái)，t-PA因其與纖維蛋白親和力高、引起全身出血傾向小、溶栓能力強(qiáng)等優(yōu)點(diǎn)而被廣泛用于各種血栓性疾病的治療。但是t-PA在血液中的半衰期甚短(3min～5min)，在臨床治療中必須大劑量靜脈滴注才能維持其有效濃度，增加了全身出血的危險(xiǎn)。目前，臨床上用于血栓性疾

2、病治療的t-PA主要靠大規(guī)模培養(yǎng)哺乳動(dòng)物細(xì)胞生產(chǎn)，存在生產(chǎn)成本高、產(chǎn)量小、濃度低等缺陷，致使t-PA價(jià)格昂貴臨床治療費(fèi)用高。利用動(dòng)物乳腺生物反應(yīng)器來(lái)生產(chǎn)不僅維持生產(chǎn)的成本低，而且產(chǎn)量高還能進(jìn)行翻譯后修飾和正確折疊。 本研究以山羊β-乳球蛋白基因調(diào)控區(qū)為指導(dǎo)元件，以人組織型纖溶酶原激活劑F、E、K1區(qū)及Asp 117糖基化位點(diǎn)缺失體為表達(dá)序列，構(gòu)建了乳腺特異性表達(dá)載體pBCrt-PA，轉(zhuǎn)染山羊乳腺上皮細(xì)胞，篩選獲得穩(wěn)定表達(dá)細(xì)胞株

3、。應(yīng)用PCR法以實(shí)驗(yàn)室保存的野生型t-PA cDNA為模板擴(kuò)增出長(zhǎng)度約1.1kb含K2和P區(qū)的t-PA部分序列。同時(shí)，合成一段長(zhǎng)度為60bp的山羊β-乳球蛋白信號(hào)肽編碼序列。利用定向克隆法，將山羊β-乳球蛋白信號(hào)肽編碼序列插入到克隆載體pCEP4中。然后，將已擴(kuò)增的t-PA cDNA序列定向克隆到山羊β-乳球蛋白信號(hào)肽編碼序列之后。再將含有CMV、山羊β-乳球蛋白信號(hào)肽編碼序列、t-PA以及SV40p(A)序列的基因片段，克隆到實(shí)驗(yàn)室已

4、有的通用乳腺特異性表達(dá)載體BnF95中，最終構(gòu)建了由山羊β-乳球蛋白基因5'、3'調(diào)控序列指導(dǎo)的t-PA cDNA突變體乳腺特異性表達(dá)載體pBCrt-PA。 進(jìn)一步用Sal I、Not I雙酶切pBCrt-PA回收大小約9.8kb的轉(zhuǎn)基因片段。通過(guò)電擊轉(zhuǎn)染法將轉(zhuǎn)基因片段導(dǎo)入體外培養(yǎng)的奶山羊乳腺上皮細(xì)胞。經(jīng)G418篩選三周后得到62株抗G418的陽(yáng)性細(xì)胞株。提取抗G418的陽(yáng)性細(xì)胞株基因組DNA，經(jīng)PCR檢測(cè)初步確認(rèn)有22株細(xì)胞

5、中整合了外源基因。用催乳素對(duì)PCR檢測(cè)陽(yáng)性細(xì)胞株進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)，收集誘導(dǎo)表達(dá)48h后細(xì)胞上清進(jìn)行ELISA檢測(cè)。檢測(cè)結(jié)果表明，有2株P(guān)CR檢測(cè)陽(yáng)性細(xì)胞株可表達(dá)t-PA突變體，但表達(dá)量相對(duì)較低，其表達(dá)水平分別為5.98ng/ml和2.35ng/ml。對(duì)于表達(dá)產(chǎn)物的活性、半衰期檢測(cè)以及如何提高表達(dá)水平有待進(jìn)一步研究。 t-PA．突變體基因的克隆以及這種載體構(gòu)建思路，為將來(lái)制備轉(zhuǎn)基因山羊乳腺生物反應(yīng)器大量生產(chǎn)特異溶栓活性強(qiáng)、半衰期延長(zhǎng)的新型溶栓