鼠抗人CD52單克隆抗體制備.pdf

1、人類(lèi)CD52抗原屬于一個(gè)只有十二個(gè)氨基酸殘基（GQNDTSQTSSPS）的GPI錨定糖蛋白，N末端在3位天冬酰氨上連接有一個(gè)具有負(fù)電荷唾液酸殘基的復(fù)雜的糖基，C末端通過(guò)與GPI錨連接而使整個(gè)分子固定在細(xì)胞膜上。CD52抗原廣泛分布于淋巴細(xì)胞、單核細(xì)胞、嗜酸性粒細(xì)胞等造血細(xì)胞上以及雄性生殖上皮細(xì)胞表面。CD52在細(xì)胞上表達(dá)密度高，就淋巴細(xì)胞而言每個(gè)淋巴細(xì)胞上約有450000個(gè)分子，約占到細(xì)胞表面成分的5％，因此成為了抗體攻擊的理想的靶抗原

2、。在1980年劍橋大學(xué)就發(fā)現(xiàn)了CD52抗體能在體外通過(guò)加入人的補(bǔ)體后殺傷帶有CD52抗原的靶細(xì)胞。因此尋找到有殺傷抑制作用的CD52抗體具有重要的應(yīng)用價(jià)值。至今最成功的抗CD52抗體藥物是Alemtuzumab（campath-1H），是一個(gè)經(jīng)過(guò)人源化改造的抗CD52單克隆抗體，被成功用于一些慢性淋巴細(xì)胞白血病和自身免疫疾病的治療和研究。
　　 本課題主要是采用雜交瘤技術(shù)制備功能性的抗人CD52單克隆抗體，同時(shí)建立穩(wěn)定CD52真

3、核轉(zhuǎn)染細(xì)胞系，以便于快速準(zhǔn)確篩選抗人CD52單克隆抗體。實(shí)驗(yàn)方法如下：
　　 首先，應(yīng)用HUT-78細(xì)胞提取細(xì)胞總RNA，運(yùn)用RT-PCR方法擴(kuò)增CD52基因，定向克隆入真核表達(dá)載體pcDNA3.1（+），用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法轉(zhuǎn)染CHO細(xì)胞，建立穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的CHO細(xì)胞系，用RT-PCR、FACS、免疫組織化學(xué)技術(shù)檢測(cè)轉(zhuǎn)染細(xì)胞系中目的基因和蛋白的表達(dá)。
　　 其次，根據(jù)NCBI提供的CD52抗原的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)及campath-1H作用

4、的抗原表位特點(diǎn)，設(shè)計(jì)合成了靠近CD52抗原C基末端的八個(gè)氨基酸的短肽，用于免疫和篩選抗人CD52單克隆抗體。
　　 最后，采用合成肽CD52-KLH免疫Balb/c鼠，進(jìn)行細(xì)胞融合與培養(yǎng)，用合成肽CD52-BSA進(jìn)行間接ELISA實(shí)驗(yàn)初步篩選，通過(guò)FACS和Western blot鑒定抗體，MTS實(shí)驗(yàn)篩選鑒定有細(xì)胞抑制作用的抗體。
　　 結(jié)果顯示建立了穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的CHO細(xì)胞系，初步篩選鑒定出兩株抗人CD52單克隆抗體，為進(jìn)