人胚胎干細胞定向誘導分化為造血細胞的實驗研究.pdf

1、血細胞輸注和造血干細胞(hematopoietic stem cells,HSCs)移植是目前細胞治療的常用手段,廣泛應用于惡性血液疾病、遺傳性疾病、感染性疾病、重癥免疫缺陷及腫瘤放化療治療后的造血支持治療等領(lǐng)域。然而,血細胞來源緊張及病原微生物傳播等問題給其臨床應用的安全性和廣泛性帶來了很大的挑戰(zhàn)。因此,人們期望尋找更為安全、經(jīng)濟和有效的血細胞和造血干細胞的資源。
　　胚胎干細胞(embryonic stem cells,ES

2、cells)在體外具有高度增殖和多向分化潛能,可定向誘導分化為神經(jīng)細胞、心肌細胞、肝臟細胞、胰島β細胞、造血細胞等多種類型的細胞。ES細胞具有比成體細胞更為廣泛的分化潛能和可塑性,是最豐富的干細胞來源,備受科學家的青睞。
　　大量的研究表明人ES細胞在體外可定向誘導分化為造血細胞,有可能為臨床輸血和造血干細胞移植,及惡性血液疾病的治療提供新途徑。目前,HSCs主要來源于臍帶血、骨髓和動員后的外周血。從臨床應用考慮,與傳統(tǒng)來源的HS

3、Cs相比,人ES細胞來源的HSCs具有很多優(yōu)勢:合適的供體骨髓的來源短缺,雖然臍帶血已建庫,但臍血中的HSCs數(shù)量仍相對不足,限制了其在成人病人中的廣泛應用。隨著干細胞及其相關(guān)技術(shù)的發(fā)展,如核移植技術(shù)以及細胞重編程技術(shù)獲得誘導性多能干細胞(induced pluripotent stem cells, iPS細胞)等有可能為HSCs的獲得提供患者自身遺傳背景的ES細胞。此外,ES細胞在體外具有無限增殖潛能,可大量擴增培養(yǎng),進而生成足夠數(shù)

4、量的HSCs,有可能成為治療各種血液疾病的新的HSCs來源。
　　目前,研究者主要采用可溶性細胞因子誘導法或造血基質(zhì)細胞共培養(yǎng)法定向誘導人ES細胞向造血細胞分化。盡管ES細胞向造血細胞分化的研究已經(jīng)取得了很大進展,且其研究和應用前景非常廣闊,但體外大規(guī)模地定向誘導人ES細胞分化為成熟紅細胞并最終應用于臨床仍有很多關(guān)鍵的問題需要解決。首先,造血發(fā)育的過程有著復雜的基因調(diào)控,目前造血細胞分化的分子調(diào)控機制尚不明確,探討ES細胞向造血細

5、胞定向誘導分化調(diào)控的機制也將會提高ES細胞體外誘導分化的效率。其次,誘導中使用的各種細胞因子多為基因工程產(chǎn)品,價格昂貴。此外,鼠源飼養(yǎng)層是目前常用的誘導方法。然而,鼠源飼養(yǎng)層所帶來的異源污染極大地限制了該研究在臨床上的廣泛應用。
　　本研究中,我們首先探討了前列腺素E2(prostaglandin,PGE2)在人ES細胞向造血細胞分化的作用并初步探討了其機制,在此基礎(chǔ)之上建立了轉(zhuǎn)染促紅細胞生成素(erythropoietin,EP

6、O)基因的人胎肝基質(zhì)細胞(human fetal liver stromalcells,hFLSCs),利用其條件培養(yǎng)基誘導人 ES細胞向紅系細胞分化,建立了一種新型誘導人ES細胞向造血細胞分化的方法,既降低了實驗成本,又可以避免異源污染。
　　本研究主要包括兩部分內(nèi)容:
　　一、PGE2促進人ES細胞向造血細胞分化
　　人ES細胞在體外可定向誘導分化為造血細胞,盡管目前已建立了多種不同的誘導體系,仍處于起步階段,細胞

7、分化調(diào)控的機制尚不清楚,成為廣大科研工作者研究的熱點。
　　PGE2是一種重要的細胞生長和調(diào)節(jié)因子。研究發(fā)現(xiàn)PGE2在正常及缺氧、感染等異常情況下對造血發(fā)育都有重要的調(diào)節(jié)作用。近年來,研究表明PGE2能夠促進造血干細胞的存活、增殖及內(nèi)環(huán)境調(diào)節(jié)方面具有一定的作用。最近研究指出PGE2能夠促進放射性損傷后的成年斑馬魚恢復造血重建能力,提示PGE2在胚胎的造血發(fā)育過程中發(fā)揮重要的作用。此外,PGE2也可促進小鼠ES細胞向造血干細胞分化。

8、因此,我們推測PGE2在人ES細胞向造血分化過程中也發(fā)揮一定作用。
　　我們通過與OP9基質(zhì)細胞共培養(yǎng)的方法考察PGE2對人ES細胞向造血細胞分化的影響:實驗組添加PGE2,對照組不添加PGE2。結(jié)果發(fā)現(xiàn),100ng/ml的PGE2可抑制集落的生長,20ng/ml的PGE2對集落生長有明顯的促進作用,接種于半固體培養(yǎng)體系生成的造血集落最多,誘導產(chǎn)生的細胞具有向造血各譜系分化能力,加入 PGE2抑制劑吲哚美辛后集落形成能力受到明顯的

9、抑制。為了觀察PGE2對人 ES細胞向造血細胞分化的影響,我們于顯微鏡下觀察共培養(yǎng)細胞的形態(tài)學變化,結(jié)果發(fā)現(xiàn)不添加PGE2的情況下,人ES細胞接種于OP9細胞上,部分向上皮樣細胞分化;部分形成血島樣的結(jié)構(gòu),隨著培養(yǎng)時間的延長類似于血島的結(jié)構(gòu)會逐漸消失、變平。在加入PGE2的情況下,大部分會形成血島樣的結(jié)構(gòu),隨著培養(yǎng)時間的延長血島樣的結(jié)構(gòu)體積變大,但形態(tài)不會發(fā)生改變。收集共培養(yǎng)3～9d的細胞,用半定量PCR檢測胚胎干細胞標志Oct4及造血

10、和內(nèi)皮相關(guān)基因的表達情況。結(jié)果表明,在不添加 PGE2的情況下,誘導的細胞持續(xù)表達Oct-4,從培養(yǎng)的第3d開始表達中胚層標志Brachyury,早期造血標志CD34和內(nèi)皮細胞標志VE-cad,從第5d開始表達造血調(diào)控相關(guān)基因Runx1,GATA1,SCL和內(nèi)皮標志vWF。在添加PGE2的情況下Oct-4的表達從培養(yǎng)第3d開始降低,共培養(yǎng)的細胞從培養(yǎng)第3d開始表達 Brachyury,CD34,Runx1,GATA1,SCL和VE-ca

11、d,從培養(yǎng)第5d開始表達vWF。這提示外源性添加PGE2可明顯促進造血和內(nèi)皮相關(guān)基因的表達。我們進一步考察了PGE2處理后Smad信號通路的變化。Western-blot結(jié)果顯示,與對照組相比,PGE2處理能夠上調(diào)p-Smad1/5的表達,同時Smad4的表達也上調(diào)。而加入PGE2的抑制劑后p-Smad1/5和Smad4的表達受到抑制,提示Smad信號通路可能參與了PGE2介導的人ES細胞向造血細胞分化。
　　二、EPO基因修飾的

12、hFLSCs條件培養(yǎng)基誘導人ES細胞向紅系細胞分化
　　在ES細胞體外誘導分化為造血細胞的過程中,研究造血微環(huán)境的調(diào)控機制是其發(fā)生和分化的重要環(huán)節(jié)。在胚胎發(fā)育的過程中,不同的造血微環(huán)境對造血的發(fā)生發(fā)揮著重要的作用。造血發(fā)生經(jīng)歷了卵黃囊造血、胎肝造血和骨髓造血三個階段。人卵黃囊造血時期發(fā)生在胚胎的4-6周;胎肝造血時期發(fā)生在胚胎的6-22周;骨髓造血時期從22周至出生以后。胎肝是造血早期發(fā)育的主要位點,是造血細胞發(fā)育和分化的重要微環(huán)

13、境,構(gòu)成其微環(huán)境的胎肝基質(zhì)細胞很有可能在造血細胞的發(fā)育和分化過程中發(fā)揮重要的作用。此外,血細胞的產(chǎn)生還受到造血干細胞內(nèi)在基因和造血因子的共同調(diào)控,EPO是其產(chǎn)生的最重要的因子。 EPO是一種糖基化的蛋白質(zhì)激素,主要來源于腎臟和肝臟,而腦、肺、脾也能產(chǎn)生少量。EPO可促進造血干細胞向原始紅細胞分化,加速幼紅細胞的分裂、增殖,促進血紅蛋白的合成,在紅細胞誘導分化研究中發(fā)揮重要作用。而造血因子提供的方式對其作用的發(fā)揮也有重要的影響。研究表明以

14、造血生長因子基因修飾的基質(zhì)細胞比相同條件下的造血生長因子更能有效地調(diào)控造血。
　　因此,本部分研究中我們采用慢病毒系統(tǒng)建立了穩(wěn)定高表達 EPO基因的hFLSCs,能夠高效分泌具有生物學活性的EPO蛋白,從而避免了添加外源性細胞因子,極大地降低了實驗成本。隨后,將人ES細胞培養(yǎng)于低黏附的細胞培養(yǎng)皿中誘導生成擬胚體(embryoid bodies,EBs),用過表達EPO基因的FLSCs條件培養(yǎng)基(EPO/hFLSCs-CM)誘導EB

15、s細胞向造血細胞分化,未轉(zhuǎn)染EPO基因的FLSCs條件培養(yǎng)基(hFLSCs-CM)作為陰性對照,未轉(zhuǎn)染EPO基因的FLSCs條件培養(yǎng)基外源性添加重組的EPO(hFLSCs-CM+EPO)作為陽性對照。收集誘導不同天數(shù)的細胞,通過流式細胞術(shù)分析誘導過程中CD34陽性的表達,以確定不同培養(yǎng)條件下 EBs向造血細胞分化的情況。結(jié)果表明三種不同的培養(yǎng)體系均能誘導人ES細胞向造血細胞分化。然而,hFLSCs-CM組的誘導效率較低,在誘導第12d中

16、CD34陽性細胞低于11％。添加外源性EPO之后,人ES細胞向造血細胞定向分化的能力增強,其中CD34+細胞最高可達13.1％。EPO/hFLSCs-CM組能更為有效地促進人ES細胞向造血細胞分化,其中CD34+細胞可高達22.74％。此外,我們還應用實時定量 PCR檢測不同組細胞造血相關(guān)基因的表達情況;應用克隆形成實驗檢測了誘導細胞的造血集落形成能力;通過瑞氏-吉姆薩染色觀查了誘導細胞的形態(tài);應用聯(lián)苯胺染色和RT-PCR方法檢測了誘導

17、造血集落珠蛋白的表達情況。結(jié)果表明,誘導生成的細胞具有造血細胞的一般特性,在半固體培養(yǎng)基中可分化為不同種類的造血集落,不同培養(yǎng)條件下產(chǎn)生的造血細胞的集落形成能力與珠蛋白的表達量不同,EPO/hFLSCs-CM誘導產(chǎn)生細胞的造血基因的表達量及所形成的造血克隆最多,且以紅系克隆為主。此外,我們還檢測了誘導產(chǎn)生的紅系細胞的攜氧能力。結(jié)果顯示,EPO/hFLSCs-CM誘導的紅系細胞具有和臍帶血相似的“S”形氧離曲線,這表明體外誘導的紅系細胞具

18、有和臍帶血相似的攜氧能力。
　　綜上所述,在本研究中我們初步考察了PGE2在人ES細胞向造血細胞分化過程中的作用并初步探討了其作用機制;并利用穩(wěn)定表達EPO基因的FLSCs條件培養(yǎng)基誘導人ES細胞向紅系細胞分化,該方法可高效誘導人ES細胞定向誘導分化為造血細胞,同時降低了研究成本,且有效避免了鼠源飼養(yǎng)層帶來的異源基因污染。上述研究為深入探討造血細胞的發(fā)育調(diào)控機制及以胚胎干細胞或造血干細胞為啟動細胞大規(guī)模地誘導產(chǎn)生紅細胞奠定了一定的