miRNA let-7a在肝內(nèi)膽管癌組織中的表達及其對膽管癌細胞生物學(xué)行為影響的實驗研究.pdf

1、miRNA let-7a在肝內(nèi)膽管癌組織中的表達及其對膽管癌細胞生物學(xué)行為影響的實驗研究
　　研究背景與目的：
　　肝內(nèi)膽管細胞癌是起源于肝內(nèi)膽管二級分支以上的一種原發(fā)于膽管上皮細胞的惡性腫瘤，或稱為肝內(nèi)型膽管癌。根據(jù)包括美國、歐洲和日本在內(nèi)的多國流行病學(xué)調(diào)查發(fā)現(xiàn)，肝內(nèi)膽管細胞癌的發(fā)病率呈現(xiàn)出明顯的上升趨勢，目前在肝臟原發(fā)性腫瘤中，其發(fā)病率已僅次于肝細胞性肝癌，約占10％～15%。肝內(nèi)膽管細胞癌的特點是起病隱匿、發(fā)展迅速、惡

2、性程度高，且由于缺乏理想的早期診斷標志物，確診時已多屬中、晚期，因此手術(shù)切除率低。盡管多年來不斷研究和探索肝內(nèi)膽管細胞癌的發(fā)生發(fā)展機制，也取得了一些診治方面的進展，但總體來說其預(yù)后仍然較差，因此加強對肝內(nèi)膽管癌細胞分子生物學(xué)特性的研究和探索新的治療方式對改善膽管癌患者的預(yù)后具有重要意義。
　　微小RNA（miRNA）是一組內(nèi)源性的非編碼RNA，廣泛存在于真核生物中，長度為18-25個核苷酸，在進化中高度保守，其通過與mRNA3`非

3、編碼區(qū)（3`UTRs）的結(jié)合調(diào)控特異靶基因的表達，從而在細胞增殖、分化、調(diào)亡等人體生理過程中起重要作用。通過疾病的miRNA表達譜與正常表達譜之間的對比，研究證實miRNA通過多種機制參與人類重大疾病(如惡性腫瘤、艾滋病、心血管系統(tǒng)疾病、神經(jīng)系統(tǒng)疾病等)的發(fā)生、發(fā)展。目前對miRNA的研究已經(jīng)成為國際上腫瘤生物學(xué)領(lǐng)域的一個新熱點。通過眾多的研究發(fā)現(xiàn)，在人類惡性腫瘤中miRNA兼有“癌基因”和“抑癌基因”的雙重作用；其既可作為癌基因，下調(diào)

4、抑癌基因的表達，也可作為抑癌基因，下調(diào)原癌基因的活性。miRNA突變、缺失或表達水平的異常都對人類腫瘤的發(fā)生發(fā)展產(chǎn)生重要影響。Lethal-7（let-7）是人類發(fā)現(xiàn)的第二個miRNA，在人類基因組中存在9個由let-7同源基因家族編碼的miRNA分子，根據(jù)既往對肺癌、乳腺癌、肝癌和結(jié)腸癌等多種人類惡性腫瘤的研究報道，它能調(diào)控細胞的分化和增殖時序進而在惡性腫瘤組織中起到抑癌基因的作用，同時也是一種潛在的早期癌癥診斷標志物和疾病預(yù)后指標。

5、
　　目前國內(nèi)外關(guān)于let-7a與肝內(nèi)膽管細胞癌的研究報道較少，其在膽管癌的發(fā)生發(fā)展中的作用和機制尚不明確，本實驗通過實時熒光定量聚合酶鏈式反應(yīng)技術(shù)（Real-time PCR）檢測let-7a在肝內(nèi)膽管癌手術(shù)切除標本和正常膽管組織中的表達，同時采用化學(xué)合成的具有增強內(nèi)源性 miRNA功能的雙鏈RNA（miRNA mimics）和具有抑制特異 miRNA功能的單鏈 RNA（miRNA inhibitor）轉(zhuǎn)染人肝內(nèi)膽管癌HuCCT

6、-1細胞株，觀察增強和抑制內(nèi)源性let-7a對膽管癌細胞增殖、凋亡和克隆形成率的影響，探討其在肝內(nèi)膽管細胞癌中的作用和為探索新的治療方法提供實驗和理論依據(jù)。
　　方法：
　　1.收集湖南省人民醫(yī)院2012年3月至10月間16例手術(shù)切除肝內(nèi)膽管細胞癌標本和9例正常膽管組織標本，應(yīng)用Real-time PCR方法檢測所有標本中l(wèi)et-7a的表達，分析正常膽管組織和膽管癌組織中l(wèi)et-7a表達的差異,并探討let-7a的表達量與肝

7、內(nèi)膽管細胞癌患者臨床病理指標之間的關(guān)系。
　　2.培養(yǎng)人肝內(nèi)膽管癌 HuCCT-1細胞株，體外化學(xué)方法合成 let-7a mimics、let-7a inhibitor和各自陰性對照，通過Lipofectamin2000轉(zhuǎn)染試劑分別轉(zhuǎn)染入人肝內(nèi)膽管癌HuCCT-1細胞，設(shè)立未轉(zhuǎn)染細胞為空白對照組，其余轉(zhuǎn)染細胞為 let-7a過表達組、let-7a抑制組、過表達陰性對照組和抑制陰性對照組，采用熒光顯微鏡直接觀察評價轉(zhuǎn)染效果，于細胞轉(zhuǎn)

8、染后的第24和48小時以Real-time PCR方法分別檢測五組細胞內(nèi)let-7a表達量的差異，評價干擾效果。
　　3.通過細胞增殖實驗（CCK8）、流式細胞術(shù)檢測細胞凋亡率以及克隆形成實驗來觀察增強和抑制let-7a對膽管癌細胞生物學(xué)行為的影響。
　　結(jié)果：
　　1.let-7a在肝內(nèi)膽管癌組織中的表達量為（0.36±0.21），而其在正常膽管組織中的表達量為（9.53±4.06），其差異有顯著的統(tǒng)計學(xué)意義（P=0

9、.00）；let-7a的低表達與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移（P=0.001）和組織學(xué)分化程度（P=0.00）有關(guān)，與患者性別、年齡、門靜脈浸潤、腫瘤大小之間無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。
　　2.let-7a mimics、inhibitor和各自陰性對照能被高效轉(zhuǎn)染入人肝內(nèi)膽管癌細胞株HuCCT-1。通過let-7a mimics轉(zhuǎn)染膽管癌細胞株HuCCT-1可顯著增強細胞內(nèi)let-7a的表達（P=0.00），通過let-7a inhibito

10、r轉(zhuǎn)染HuCCT-1細胞株可有效抑制細胞內(nèi)let-7a的表達量（P=0.00），轉(zhuǎn)染各自陰性對照試劑的對照組細胞和HuCCT-1細胞自然生長的空白對照組之間，let-7a的表達量無統(tǒng)計學(xué)差異（P＞0.05）。
　　3.CCK8實驗中增強細胞內(nèi)let-7a表達可抑制膽管癌細胞HuCCT-1的增殖（P=0.00），而抑制let-7a的表達可促進膽管癌細胞HuCCT-1的增殖（P=0.00），過表達陰性對照組、抑制陰性對照組和空白對照組

11、之間細胞增殖差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）；上調(diào)let-7a的表達可明顯促進HuCCT-1細胞的凋亡（P=0.00），抑制let-7a的表達則可明顯抑制HuCCT-1細胞的凋亡率（P=0.00），兩組陰性對照和空白對照組細胞之間凋亡率的差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）；過表達let-7a的膽管癌HuCCT-1細胞其克隆形成率明顯降低（P<0.05）而抑制let-7a表達的HuCCT-1細胞其克隆形成率明顯升高（P<0.05），空白對照

12、組和過表達陰性對照組、抑制陰性對照組之間差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。
　　結(jié)論：
　　1.let-7a在肝內(nèi)膽管癌組織中的表達明顯下調(diào)，let-7a的下調(diào)可能在肝內(nèi)膽管癌的發(fā)生發(fā)展中起到促進作用。
　　2.Let-7a的低表達提示患者存在較高的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移率和較低的組織學(xué)分化程度。
　　3.let-7a mimics可以明顯增強人肝內(nèi)膽管癌細胞株HuCCT-1中l(wèi)et-7a的表達，let-7a inhibit