表達(dá)載體信號肽改造提高畢赤酵母植酸酶phyA基因表達(dá)量研究.pdf

1、植酸酶可以提高飼料中磷的利用率和減少糞便中磷的排出量，對減少畜禽糞便中磷對環(huán)境的污染和提高飼料利用率有重大價值，提高植酸酶的表達(dá)量，對工業(yè)化生產(chǎn)有重要意義。 本研究以本課題組構(gòu)建的植酸酶畢赤酵母基因工程PP-NPm-8和PP-NPm-4-8為出發(fā)菌株，根據(jù)畢赤酵母的信號肽序列，按照酵母偏愛密碼，人工合成畢赤酵母的新型信號肽MS，并構(gòu)建了新型酵母表達(dá)載體pPIC9k-MS，并進(jìn)行了酶切鑒定。將本課題組來源于黑曲霉N25植酸酶phy

2、A基因的突變基因phyAm和突變基因phyAm-4分別插入pPCI9K-MS載體中，構(gòu)建重組質(zhì)粒pPIC9k-MS-phyAm和pPIC9k-MS-phyAm-4，并進(jìn)行PCR鑒定，然后電擊轉(zhuǎn)化畢赤酵母，篩選獲得了植酸酶畢赤酵母基因工程菌株P(guān)P-MS-NPm-77和PP-MS-NPm-4-16。 植酸酶畢赤酵母基因工程菌PP-MS-NPm-77和PP-MS-NPm-4-16表達(dá)產(chǎn)物的SDS-PAGE分析表明，酶蛋白分子大小為70

3、.15KD。PCR鑒定結(jié)果表明，突變基因phyAm和突變基因phyAm-4都已整合到酵母染色體DNA中。連續(xù)傳10代培養(yǎng)實驗證實，植酸酶畢赤酵母基因工程菌的遺傳穩(wěn)定。 植酸酶畢赤酵母基因工程菌PP-MS-NPm-77酶活性測定結(jié)果表明，在BMGY/BMMY培養(yǎng)基中誘導(dǎo)36h后酶活力可達(dá)179150u/ml，比出發(fā)菌株P(guān)P-NPm-8的63667u/ml提高了2.81倍，在麥芽汁培養(yǎng)基中，誘導(dǎo)36h后酶活力達(dá)188130u/ml，

4、比PP-NPm-8的47600u/ml提高了3.95倍。 植酸酶畢赤酵母基因工程菌PP-MS-NPm-4-16酶活性測定結(jié)果表明，在BMGY/BMMY培養(yǎng)基中誘導(dǎo)36h后酶活力可達(dá)201800u/ml，比出發(fā)菌株P(guān)P-NPm-4-2的133800u/ml提高了1.51倍，在麥芽汁培養(yǎng)基中，誘導(dǎo)36h后酶活力達(dá)209600u/ml，比PP-NPm-4-2的136900u/ml提高了1.53倍。 本研究通過表達(dá)載體信號肽的改