巴斯德畢赤酵母新型分泌型表達載體的構(gòu)建.pdf_第1頁
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文檔簡介

1、用化學合成的方法合成INUA、INUB、INUC三個先導肽DNA片段, 經(jīng)BamHI和EocRI酶切后,與同樣雙酶切處理的質(zhì)粒pPIC3.5K重組構(gòu)建得到一個套具有INU 先導序列的新型分泌型畢赤酵母表達系統(tǒng)即pPICINUA,pPICINUB,pPICINUC.設(shè)計并合成一對引物, 用PfuDNA聚合酶從大腸桿菌基因組上PCR擴增出天冬酰成熟肽基因序列(簡稱ASN序列), 經(jīng)EcoRI酶處理后插入pPICINUA和pPIC9K中,得到

2、表達質(zhì)粒pPICINUA-ASN和pPIC9K-ASN,將這兩個表達質(zhì)粒與空白質(zhì)粒pPIC9K經(jīng)SacI酶切線性化后用原生質(zhì)體法轉(zhuǎn)化入Pichiapastoris的GS115菌株中, 經(jīng)過篩選得到5個Mut<'+>型菌株即GS115/INUA-ASN0.25、GS115/INUA-ASN4.0、GS115/9K-ASN0.25、GS115/9K-ASN4.0和GS115/pPIC9K,將這五個菌株與GS115/β-Gal一起用甲醇培養(yǎng)基

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