共表達PDI提高IFNβ-HSA在畢赤酵母中表達的研究.pdf

1、β干擾素(IFNβ)是干擾素家族中的一員，具有廣譜抗病毒、抗細胞增殖和免疫調節(jié)作用。為了改善IFNβ的體內穩(wěn)定性，雷楗勇等構建了β干擾素與人血清白蛋白融合蛋白(IFNβ-HSA)融合基因，將其在畢赤酵母系統(tǒng)中進行表達，得到了長效融合蛋白IFNβ-HSA。這種融合蛋白具有廣闊的生產及臨床應用前景。但是該菌株表達量較低，為進一步提高IFNβ-HSA的表達量，本文構建雙重重組酵母，使其共表達具有分子伴侶活性的蛋白質二硫鍵異構酶(PDI)，并分

2、析產量差異。為進一步提高IFNβ-HSA定量分析方法的靈敏度，本文對實驗條件進行優(yōu)化，并對新方法進行考核。
　　 參照GenBank數(shù)據(jù)庫登記號為EU805807的PDI基因序列設計引物，以畢赤酵母基因組為模板，采用PCR方法，擴增PDI基因。將其插入到克隆載體pMD19-T中，構建重組質粒pMD19T-PDI，進行測序。測序結果顯示克隆得到的PDI基因與GenBank公布的PDI基因序列完全一致。將該基因插入畢赤酵母表達載體p

3、PICZα-A中，構建重組表達載體pPICZαA-PDI，經(jīng)Sac I線性化后電擊轉化畢赤酵母KM71/pPIC9K-IFNβ-HSA，得到雙重表達PDI和IFNβ-HSA的雙重重組子。搖瓶發(fā)酵結果表明，共表達PDI的菌株較原始菌株目的蛋白IFNβ-HSA產量提高60％。
　　 IFNβ-HSA雙抗體夾心ELISA檢測方法的優(yōu)化。將純化后的IFNβ-HSA融合蛋白作為抗原標準品，優(yōu)化緩沖體系、抗體工作濃度及實驗條件，建立了新的檢

4、測方法。該方法的靈敏度達到13.88ng/mL，線性檢測范圍21.01ng/mL～672.50ng/mL，相關系數(shù)R2＞0.99。經(jīng)方法學考核，批內、批間變異系數(shù)分別為2.46～8.89％和2.79～9.74％，發(fā)酵液上清回收率為91.30～108.44％，與IFNβ、HSA基本無交叉反應，健全性分析表明發(fā)酵液及小鼠血清稀釋倍數(shù)對該方法無影響，穩(wěn)定性試驗顯示預包被酶標板可在4℃下穩(wěn)定保存3個月以上。
　　 本文研究結果表明共表達