酸性植酸酶phyB基因在巴斯德畢赤酵母GS115中的表達(dá)研究.pdf

1、本文通過PCR方法擴(kuò)增到無信號(hào)肽無內(nèi)含子的植酸酶phyB基因，PCR產(chǎn)物被克隆到pUCm-Tvector上，并進(jìn)行測序，基因序列與文獻(xiàn)報(bào)道的相比有7個(gè)堿基不同，3個(gè)氨基酸不同，活性中心沒有任何變化，成熟肽共有460個(gè)氨基酸。將植酸酶phyB基因與穿梭質(zhì)粒pPIC9K連接，構(gòu)建重組質(zhì)粒pPIC9K-phyB，用電轉(zhuǎn)法轉(zhuǎn)化畢赤酵母GS115，用RDB、MM、MD培養(yǎng)基篩選到轉(zhuǎn)化子。在甲醇的誘導(dǎo)下，該植酸酶phyB基因在畢赤酵母中得到了表達(dá)。

2、經(jīng)SDS-PAGE凝膠電泳分析，該重組蛋白的分子量為75KD，而該植酸酶在大腸桿菌DH5α表達(dá)系統(tǒng)中表達(dá)的分子量為60KD，這可能是由于糖基化的結(jié)果。酶學(xué)性質(zhì)檢測發(fā)現(xiàn)，表達(dá)的植酸酶的最適作用溫度為65℃，比野生原始菌株的提高了10℃；誘導(dǎo)pH值為5.5時(shí)，蛋白的表達(dá)量最高，為10528.6U/ml，是野生菌株的2.8倍；最適作用pH值為2.5，與報(bào)道的一致；在70℃的條件下處理5min，該酶的相對(duì)酶活力為90％，處理60min后相對(duì)酶活