畢赤酵母表達(dá)牛氣管抗菌肽的研究.pdf

1、牛氣管抗菌肽(bTAP)是牛氣管黏膜上皮細(xì)胞分泌的具有廣譜抗菌活性的多肽。與抗生素的作用機(jī)制不同，抗菌肽為動(dòng)物體天然的防御因子，不易產(chǎn)生耐藥菌株，是一類具有巨大發(fā)展?jié)摿Φ男滦涂咕幬铮烊豢咕牡漠a(chǎn)量極低。畢赤酵母(Pichia Pastoris)不僅具有真核表達(dá)系統(tǒng)的蛋白翻譯后加工修飾等優(yōu)點(diǎn)，而且基因操作相對(duì)簡(jiǎn)單，表達(dá)水平較高。 本研究根據(jù)已發(fā)表的bTAP基因序列和酵母細(xì)胞的密碼子偏愛性設(shè)計(jì)兩對(duì)引物，以重疊延伸PCR擴(kuò)增出b

2、TAP成熟肽編碼序列，然后將其構(gòu)建到巴斯德畢赤酵母分泌型表達(dá)載體pPIC9K中，用限制性內(nèi)切酶Sal Ⅰ或BglⅡ酶切線性化后轉(zhuǎn)化畢赤酵母GS115株感受態(tài)細(xì)胞，在組氨酸缺乏的培養(yǎng)基上篩選得轉(zhuǎn)化酵母菌，然后在含不同濃度G418的YPD平板上培養(yǎng)，篩選得抗3mg/ml G418的Mm+型重組酵母菌3株，抗1mg/ml G418的Muts型酵母菌1株。在此基礎(chǔ)上，以初次轉(zhuǎn)化的重組酵母菌制備感受態(tài)細(xì)胞，用同樣線性化的重組質(zhì)粒進(jìn)行二次電轉(zhuǎn)化，并