煙熏曲霉植酸酶基因phyA的克隆及其在畢赤酵母中的表達(dá).pdf

1、植酸酶是一種能將植酸磷(六磷酸肌醇)降解為肌醇和無(wú)機(jī)磷酸的酸性磷酸酶類(lèi).在飼料中添加植酸酶不但可以提高動(dòng)物對(duì)磷的吸收,降低環(huán)境中磷的污染,而且能解除植酸對(duì)金屬離子、氨基酸的螯合作用,大大提高飼料的利用效率.自然界中大量高活性的植酸酶主要存在于真菌中,大多數(shù)是絲狀真菌.國(guó)內(nèi)外科技工作者對(duì)植酸酶基因克隆及其表達(dá)的研究已有許多成功的報(bào)道,大幅度提高了植酸酶的產(chǎn)量,并且實(shí)現(xiàn)了工業(yè)化的生產(chǎn).一般認(rèn)為黑曲霉(Aspergillus niger)產(chǎn)生

2、的植酸酶活性最強(qiáng),因此工業(yè)化生產(chǎn)的工程菌中植酸酶基因大都來(lái)自于黑曲霉,但是這種來(lái)源于黑曲霉的植酸酶不能耐受較高的溫度,在干燥和制粒加工過(guò)程中酶活大量喪失.而煙熏曲霉(A.fumigatus)中分離的植酸酶能夠耐受90℃~100℃的高溫,并且能在較寬的pH范圍內(nèi)降解植酸,具有較大的市場(chǎng)潛力.該研究根據(jù)已發(fā)表的植酸酶phyA基因全序列設(shè)計(jì)一對(duì)引物,用PCR方法從煙熏曲霉(A.fumigatus)CCTCC AF93024總DNA中擴(kuò)增到去除

3、信號(hào)肽和內(nèi)含子后約1.3kb的phyA基因編碼區(qū)片段,對(duì)該片段進(jìn)行了克隆及序列測(cè)定.以此片段成功構(gòu)建了pPIC9K-phyA表達(dá)載體,并轉(zhuǎn)化畢赤酵母GS115(Pichia pastoris).通過(guò)表達(dá)產(chǎn)物的酶活性檢測(cè)和SDS-PAGE電泳分析,重組轉(zhuǎn)化子中植酸酶得到了有效分泌和高效表達(dá).搖瓶誘導(dǎo)發(fā)酵48h發(fā)酵液中植酸酶的活性可以達(dá)到113u/mL;表達(dá)產(chǎn)物在pH2.0~8.0均有活性,最適作用pH為6.0,最適作用溫度為60℃,并且具