牛乳鐵蛋白肽衍生肽的設(shè)計(jì)及其在畢赤酵母中表達(dá)與活性分析.pdf

1、牛乳鐵蛋白肽（LfcinB，lactoferricin Bovine）是一種含25個(gè)氨基酸殘基的抗菌短肽（FKCRRWQWRMKKLGAPSITCVRRAF）由牛乳鐵蛋白（LfB，lactoferrin Bovine）在胃蛋白酶水解消化作用下由N-末端釋放，具有廣譜抗菌性，良好的耐熱性，免疫調(diào)節(jié)作用，無(wú)抗原性和對(duì)腸道益生菌無(wú)害性等特點(diǎn)。在不同來(lái)源的乳鐵蛋白肽中，牛乳鐵蛋白肽的生物活性最高，因此牛乳鐵蛋白肽及其衍生肽的研究應(yīng)用受到越來(lái)越多

2、的關(guān)注，研究學(xué)者們期望能夠通過(guò)體外表達(dá)系統(tǒng)獲得高活性表達(dá)以及穩(wěn)定的LfcinB及其衍生肽，使其成為新型的抗生素替代物。
　　甲醇營(yíng)養(yǎng)型酵母表達(dá)系統(tǒng)已廣泛應(yīng)用于外源真核和原核蛋白的生產(chǎn)表達(dá)。作為一種成功的真核表達(dá)系統(tǒng)，其具有許多優(yōu)點(diǎn)：（1）強(qiáng)有力的啟動(dòng)子（醇氧化酶基因，AOXⅠ）調(diào)控外源基因表達(dá)；（2）能高密度生長(zhǎng)發(fā)酵，且營(yíng)養(yǎng)要求低；（3）具有對(duì)表達(dá)蛋白進(jìn)行翻譯后修飾和加工功能；（4）自身分泌蛋白少，目標(biāo)蛋白的純化簡(jiǎn)單。研究表明，畢

3、赤酵母表達(dá)系統(tǒng)已成功表達(dá)了200多種來(lái)源不同的外源蛋白產(chǎn)品。
　　本論文利用生物信息學(xué)工具、抗菌肽數(shù)據(jù)庫(kù)以及蛋白質(zhì)分析軟件，對(duì)抗菌肽結(jié)構(gòu)與功能的關(guān)系進(jìn)行了分析，然后對(duì)對(duì)牛乳鐵蛋白肽衍生肽（LfcinBD）進(jìn)行優(yōu)化設(shè)計(jì)。將設(shè)計(jì)的牛乳鐵蛋白肽衍生肽基因與畢赤酵母表達(dá)載體pPIC9K構(gòu)建重組表達(dá)載體pPIC9K-LfcinBD。將重組質(zhì)粒線(xiàn)性化后電轉(zhuǎn)化感受態(tài)畢赤酵母細(xì)胞GS115，利用遺傳霉素G418，篩選高拷貝的抗性轉(zhuǎn)化子。實(shí)驗(yàn)對(duì)發(fā)酵

4、上清液進(jìn)行了分離純化和活性測(cè)試，SDS-PAGE電泳檢測(cè)到了目標(biāo)蛋白的有效表達(dá)。實(shí)驗(yàn)還對(duì)優(yōu)化設(shè)計(jì)得到的牛乳鐵蛋白肽衍生肽與同等發(fā)酵條件下產(chǎn)生的天然牛乳鐵蛋白肽的抑菌活性進(jìn)行了對(duì)比分析，結(jié)果證明設(shè)計(jì)得到的衍生肽對(duì)金黃色葡萄球菌有更強(qiáng)的抑菌活性。研究表明經(jīng)色氨酸Trp替換的牛乳鐵蛋白肽衍生肽，其疏水性提高，增加了與細(xì)菌膜脂質(zhì)雙分子層作用，促進(jìn)了LfcinBD的抑菌活性，證明了LfcinBD設(shè)計(jì)的合理性。為進(jìn)一步探究LfcinBD的生物活性奠