杏鮑茹(Pleurotus ervngii)漆酶基因的體外誘變及在畢赤酵母中表達(dá).pdf

1、漆酶屬于銅藍(lán)氧化酶,是一種重要的木質(zhì)素降解酶,參與自然界木質(zhì)素的循環(huán)和利用,同時(shí)漆酶對(duì)與木質(zhì)素結(jié)構(gòu)相似的許多環(huán)境污染物也有明顯的降解能力,因此漆酶在環(huán)境保護(hù)、造紙工業(yè)、食品工業(yè)、及生物傳感器、免疫檢測(cè)等領(lǐng)域的重要性越來(lái)越明顯。漆酶在自然界中主要是白腐菌產(chǎn)生的,但白腐菌產(chǎn)漆酶的能力較低,很難滿足工業(yè)發(fā)酵的需求。杏鮑菇是從常見(jiàn)白腐菌中篩選出來(lái)的,其最適作用溫度較高且熱穩(wěn)定性和pH值穩(wěn)定性也比較好。本課題以杏鮑菇組成型漆酶的cDNA序列(Ge

2、nBank序列號(hào)為FJ231091)為材料,即pMD19T-lac為模板,運(yùn)用易錯(cuò)PCR和重疊延伸PCR對(duì)漆酶基因進(jìn)行體外誘變,獲得突變基因,并構(gòu)建了重組克隆載體和重組表達(dá)載體,用于研究漆酶的異源表達(dá)情況,實(shí)現(xiàn)漆酶的高密度發(fā)酵和縮短漆酶的生產(chǎn)周期。為工業(yè)化生產(chǎn)打下良好的基礎(chǔ),并為將來(lái)對(duì)漆酶進(jìn)行進(jìn)一步分子改造以及快速定向進(jìn)化奠定基礎(chǔ)。論文共分三個(gè)部分。
　　 1.以來(lái)自杏鮑菇的漆酶基因(pMD19T-lac)為模板,采用易錯(cuò)PCR

3、(error-prone PCR)對(duì)漆酶基因進(jìn)行體外誘變,建立突變庫(kù),篩選突變基因,構(gòu)建畢赤酵母表達(dá)系統(tǒng),但未見(jiàn)活性表達(dá)。隨機(jī)挑選突變體測(cè)序,結(jié)果表明,其中一個(gè)突變基因共有兩個(gè)堿基發(fā)生了突變,均發(fā)生在T、C之間,其中第209位Val→Ala,另一個(gè)為第237位Pro的同義突變。這兩個(gè)位點(diǎn)分別處于結(jié)構(gòu)域1的1個(gè)β-折疊片和一段無(wú)規(guī)卷曲上,參與和T2/T3三核簇的連接。
　　 2.以易錯(cuò)PCR篩選到的突變體基因?yàn)槟０?用疊延伸PCR

4、法(OE—PCR)將GCC回復(fù)突變?yōu)楦弑磉_(dá)優(yōu)越密碼子GTC,即實(shí)現(xiàn)了Ala→Val。含突變位點(diǎn)的基因(lacM)與pMD19T-Simple Vector連接,構(gòu)建為重組克隆載體pMD19-lacM。
　　 3.含突變位點(diǎn)的基因(lacM)與畢赤酵母分泌型表達(dá)載體pHBM905A連接,構(gòu)建為重組表達(dá)載體pHBM905AM,線性化后電轉(zhuǎn)化進(jìn)畢赤酵母GS115,利用釀酒酵母α-factor作為信號(hào)肽,在GS115中誘導(dǎo)表達(dá)成功。雖檢