重組畢赤酵母表達(dá)水蛭素的發(fā)酵工藝研究.pdf

1、天然水蛭素是從醫(yī)用水蛭的唾液腺分泌的一種小分子活性多肽，是目前已知的自然界中最強(qiáng)的抗凝血因子，可有效防治血栓性疾病。由于天然水蛭素原料有限，產(chǎn)量低，成本高，限制了其臨床應(yīng)用，從而采用基因工程技術(shù)開發(fā)重組水蛭素，可克服以上不足。 本文對(duì)基因工程菌畢赤酵母表達(dá)外源蛋白水蛭素的發(fā)酵工藝進(jìn)行了深入的研究。通過搖瓶培養(yǎng)篩選發(fā)酵條件，研究了工程菌的生長特性，通過單因素和正交實(shí)驗(yàn)，確定了工程菌的最佳生長和表達(dá)條件。在搖瓶研究的基礎(chǔ)上，用30

2、L發(fā)酵罐進(jìn)行了放大培養(yǎng)表達(dá)實(shí)驗(yàn)。依據(jù)工程菌生長狀態(tài)來變速流加甘油和甲醇的培養(yǎng)方式下，考察了溶氧、溫度、pH、外營養(yǎng)物的添加以及改變誘導(dǎo)菌體密度對(duì)工程菌生長與表達(dá)的影響。結(jié)果顯示，在整個(gè)發(fā)酵過程中溶氧控制在30-50％有利于工程菌的生長和表達(dá)；在表達(dá)階段，控制溫度為24℃、pH 4.0、添加1％的酪蛋白水解物，當(dāng)菌體濕重達(dá)到320g/L后開始誘導(dǎo)，水蛭素的抗凝活力可達(dá)到30000 ATU/ml。綜合確定了發(fā)酵結(jié)束時(shí)間為誘導(dǎo)后42小時(shí)，表達(dá)