IL1Ra-HSA基因的克隆及其在畢赤酵母中的表達.pdf_第1頁
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文檔簡介

1、湖北大學碩士學位論文IL1RaHSA基因的克隆及其在畢赤酵母中的表達姓名：胡磊申請學位級別：碩士專業(yè)：微生物與生化藥學指導教師：劉夢元20090501AbstractInterleukin一1receptorantagonist(IL一1Ra)，anaturallyoccurringantagonistoftheproinflammatorycytokineIL1IL1RacompetitivelyblocksthebindingofI

2、L壚toIL1membranereceptorsandhasawonderfultherapeuticeffectFortheinflammation，autoimmunediseasesToprolongthehalflifeofIL1Rainvivo，wedevelopedalong—actingIL1Ra(ILIRaHSA)byalbuminfusiontechnologyThefusedgeneILIRa—HSAwasexpre

3、ssedinPichiapastorisGSll5ThewholeaminoacidssequenceofILlRawasbacktranslatedintoDNAsequencewiththepriorcodonsofPichiapastoris14oligonucleotidesweresynthesizedbasedontheDNAsequenceandthePCRwasperformedtoassemblethe14oligon

4、ucleotidestoanintactgenefragmentcodingforILl—RaThegenefragmentwasclonedintovectorpUCM—TandtransformedintoEcoliDH5ahostbacteriaPCRidentifiedthebacteriaandsequencedfromselectedpositiveclonedbacteriaTheresultsshowedthatthew

5、hole458bpofILl—RawereClonedsuccessfullyAccordingtotheeDNAsequenceofHSAderivedfromtheGenebank(V00495)，apairofprimerswasdesignedRTPCRwasappliedtoamplifythewholeeDNAofHSAgeneTheeDNAfragmentWasclonedintovectorpUCM—Tandtransf

6、ormedintoEcoliDH5ahostbacteriaPCRidentifiedthebacteriaandsequencedfromselectedpositiveclonedbacteriaTheresultsshowedthatthewhole1758bpeDNAofHSAwereClonedsuccessfullyandcomparedwiththesequencedepositedinGeneBanks，andtheho

7、mologywas9999％AftersplicingILl—RaandHSAgengesinvitrobyoverlappingPCRtechnologythefusedgenewasclonedintoplasmidpMD18一TandthensequencedTherecombinantplasmidwasnamedpMDl8TILIRaHSATheconfirmedfusedgenewasrecoveredfromtheplas

8、midwithrestrictionendouncleaseCpoIandNotltheninsertitintoexpressionvectorpHBM9005BtoconstructrecombinantexpressionvectorpHBM—ILlRaHSATheresultsshowedthattheclonedfusedgenewasincorrespondencewithouranticipationandexpressi

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