家蠶內(nèi)皮單核細胞激活多肽Ⅱ基因的克隆與原核表達.pdf

1、內(nèi)皮-單核細胞激活多肽Ⅱ(edothelialmonocyteactivatingpolypeptideⅡ，EMAPⅡ)是由前體物質(zhì)proEMAPⅡ分解而成的，能夠改變內(nèi)皮和單核細胞的功能，具有促進細胞凋亡和抑制腫瘤血管生成的特性，目前EMAPⅡ主要被用于腫瘤治療的實驗研究。為了獲得大量有活性的EMAPⅡ，本研究開展了對BmEMAPⅡ基因的克隆、轉(zhuǎn)錄水平差異及重組表達的研究。
　　 本實驗根據(jù)已公布的家蠶基因組精細圖譜和EST等

2、公共數(shù)據(jù)庫的序列信息，我們設(shè)計特異性引物克隆出家蠶BmEMAPⅡ基因的cDNA和DNA序列，獲得ORF和其全長序列，分別為870bp和1186bp。全長序列由3個外顯子和2個內(nèi)含子組成，該基因ORF編碼289個氨基酸，預(yù)測蛋白分子量約為32kDa，理論等電點為8.31；該蛋白屬于親水性蛋白，沒有明顯的跨膜結(jié)構(gòu)域，無明顯的信號肽，且亞細胞定位在線粒體或胞外的可能性很小，最有可能位于其它部位。鄰接法構(gòu)建的進化樹顯示家蠶與二化螟親緣關(guān)系最近，

3、與哺乳動物人和小鼠的距離較遠。
　　 提取家蠶不同時期和不同組織的總RNA，以M-MLV反轉(zhuǎn)錄第一鏈cDNA，以家蠶18SrRNA基因做內(nèi)參，進行了半定量RT-PCR。結(jié)果表明BmEMAPⅡ基因除了在蛹期的體壁、出蛾當(dāng)天的翅膀中不表達，在其它的組織中都表達，這說明家蠶內(nèi)皮單核細胞激活多肽Ⅱ基因在不同時期和不同組織中的表達是有差異的。
　　 將擴增的ORF片段連接至pET-28a(+)表達載體，并誘導(dǎo)其原核表達，經(jīng)免疫印跡