家蠶squid基因的原核表達和定位分析.pdf

1、BmSQD-1蛋白(Bombyx mori SQIYID protein)首次在家蠶中進行研究。BmSQD-1蛋白含有兩個RRM保守結(jié)構(gòu)域,RRM基序中含有許多保守的氨基酸,RRM RNA結(jié)合蛋白,參與RNA前體的剪接,RNA的細胞定位及保持RNA的穩(wěn)定性等多種轉(zhuǎn)錄后調(diào)控過程,人體中RRM RNA結(jié)合蛋白與某些人類遺傳性疾病及腫瘤相關(guān)。果蠅中squid基因編碼一些核不均-核糖核蛋白的亞型,通過RNA的選擇性剪切編碼至少三種蛋白,分別包含

2、345,321,308個氨基酸殘基。每種亞型擁有共同的前285個氨基酸殘基,共同的N末端有兩個RNA結(jié)合基序,這些蛋白質(zhì)是hnRNP復(fù)合物的主要組成成分。推測BmSQD-1蛋白即為一類核不均-核糖核蛋白。
　　 我們從本實驗室構(gòu)建的家蠶蛹cDNA文庫中獲得一條cDNA序列,該基因序列長為864bp,編碼268個氨基酸殘基,預(yù)測分子量為30.99kDa。將該基因的ORF克隆到大腸桿菌載體pET-28a(+)中,構(gòu)建了原核表達質(zhì)粒p

3、ET-28a(+)-Bmsqd-1,并轉(zhuǎn)化感受態(tài)細胞E.coli BL21(DE3),經(jīng)IPTG誘導(dǎo)表達后SDS-PAGE檢測,發(fā)現(xiàn)在約35kDa處有一特異性條帶,經(jīng)重組質(zhì)粒測序和質(zhì)譜檢測表明表達的重組蛋白完全正確。超聲裂解菌體離心,SDS-PAGE檢測,發(fā)現(xiàn)融合蛋白存在于上清中。采用親和層析的方法純化融合蛋白,以純化的重組蛋白免疫雄性新西蘭兔,制備了該重組蛋白的多克隆抗體,并用Protein A凝膠柱純化多克隆抗體。ELISA檢測結(jié)果