單核細胞增生性李斯特氏菌溶血素基因的克隆與原核表達.pdf

1、單核細胞增生性李斯特氏菌(Listeria Monocytogenes,LMO)是李斯特氏菌屬的重要成員,屬于細胞內(nèi)寄生的革蘭氏陽性桿菌.該菌在病原學上作為一種重要的人畜共患和食源性疾病的病原菌在公共衛(wèi)生學上有重要意義,近幾年已在許多國家報道由LMO引起的李斯特氏菌病及食物中毒.本菌可致人和動物患腦膜炎、敗血癥、腦膜腦炎、流產(chǎn)等,發(fā)病率雖低,但死亡率高達30﹪~70﹪.Hemolysin(hly)基因是LMO的毒力標志基因,屬于巰基活化

2、的結(jié)合膽固醇的細胞溶血素家族,是LMO必要的致病因子.該實驗根據(jù)GeneBank已發(fā)表的LMO hly完整基因序列,設(shè)計并合成分別帶有SalI和XbaI酶切位點的上下游引物TU、TL,以LMO 0586株總DNA為模板,應(yīng)用PCR技術(shù),擴增得到hly全基因.將純化的該基因片段克隆到pMD18-T載體中,通過單雙酶切及PCR鑒定篩選帶有插入片段的陽性重組質(zhì)粒,命名為pMD18-T-hly.對克隆的hly基因進行序列測定,測序結(jié)果顯示LMO

3、 0586 hly基因全長1646bp,含有完整的開放閱讀框架,編碼529個氨基酸.運用DNAMAN軟件將測序結(jié)果與國外報道的LMO F6789株、LMO F2365株進行同源比較,結(jié)果顯示,核苷酸序列同源性分別為99.70﹪和99.39﹪.推導出的氨基酸序列與其相應(yīng)菌株比較,同源性分別為99.82﹪和98.90﹪.以重組質(zhì)粒pMD18-T-hly為模板,重新設(shè)計并合成分別含有BamHI、XhoI酶切位點的上下游引物PU、PL,通過PC

4、R擴增hly基因,然后將其定向克隆到原核表達載體質(zhì)粒pGEX-6P-1的BamHI與XhoI之間,命名為pGEX-6P-hly.將鑒定的陽性重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)細胞BL21(DE<,3>)中.挑選含重組質(zhì)粒的菌落,經(jīng)IPTG(1.0mmol/L)誘導后,經(jīng)SDS-PAGE分析,目的蛋白與谷胱甘肽巰基轉(zhuǎn)移酶(GST大小約為26ku)融合后的重組蛋白大小約為72ku.光密度掃描對表達產(chǎn)物進行初步定量表明,72ku融合蛋白占菌體總蛋白的