家蠶超氧化物歧化酶基因Bmsod3的克隆與原核表達(dá).pdf

1、在氧化還原循環(huán)的過(guò)程中,活性氧(Reactive Oxygen Species,ROS)是生物體正常氧代謝的副產(chǎn)物,其在細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo)和保持機(jī)體正常代謝起信使作用。ROS包括:超氧陰離子自由基(O2._)、羥自由基(.OH)及過(guò)氧化氫(H2O2)等)。極端環(huán)境影響下(如暴露于紫外線或熱源下等),ROS的量便會(huì)急劇增多,會(huì)使得生物體內(nèi)的大分子都會(huì)發(fā)生不可逆的損傷,如:DNA分子結(jié)構(gòu)的損傷、脂質(zhì)氧化及酶活性結(jié)構(gòu)的不可逆損傷等一系列氧化損傷,進(jìn)

2、而引起生物體的各種生理病變。過(guò)去的研究已報(bào)道了幾種對(duì)活性氧代謝平衡和生物體生存起關(guān)鍵作用的抗氧化酶。而超氧化物歧化酶(superoxide dismutase, SOD)就是其中的一種幾乎存在于所有的好氧生物中的關(guān)鍵抗氧化酶,也是唯一一種可以直接代謝超氧化物類活性氧的酶類。
　　經(jīng)家蠶 NPV病毒誘導(dǎo)處理的家蠶組織,我們發(fā)現(xiàn)其活性氧水平會(huì)顯著升高。篩選家蠶免疫芯片數(shù)據(jù)發(fā)現(xiàn)經(jīng) NPV等主要的幾種家蠶病原誘導(dǎo)后,Bmsod3基因的表達(dá)

3、水平明顯上調(diào)。預(yù)測(cè)其蛋白可能與NPV抗性有關(guān)。SOD蛋白作為第一道抗氧化酶類防線,可能有抗氧化作用?；诖?本文將首先克隆及原核表達(dá)家蠶Bmsod3基因,試圖闡明其功能,獲得結(jié)果如下:
　　1)BmSOD3作為胞外SOD蛋白,與其他昆蟲(chóng)的SOD3蛋白之間有較高的序列相似性,與岡比亞按蚊(A. gambiae)達(dá)到65％。家蠶超氧化物歧化酶3(Bmsod3)基因在染色體上的唯一定位,位于8號(hào)染色體上的nscaff2828位置。Bms

4、od3基因的整個(gè)CDS長(zhǎng)度為606bp。BmSOD3作為胞外SOD蛋白,經(jīng)預(yù)測(cè)其具有信號(hào)肽的概率為:0.843,信號(hào)肽剪接位點(diǎn)位于第21位氨基酸甘氨酸和22位氨基酸谷氨酸之間。預(yù)測(cè)的BmSOD3蛋白理論等電點(diǎn)為5.87,理論質(zhì)量為:18.96kD,加上組氨酸標(biāo)簽以后的質(zhì)量約為21kD。BmSOD3蛋白的結(jié)構(gòu)位點(diǎn)中的65、80、100、140位殘基為該蛋白的催化歧化反應(yīng)的活性位點(diǎn);65、80、140位殘基為該蛋白的Cu2+結(jié)合位點(diǎn);而80

5、、90、100位殘基為 Zn2+結(jié)合位點(diǎn),其中 Cu2+、Zn2+結(jié)合位點(diǎn)都是相應(yīng)的催化活性中心位點(diǎn)所在。
　　2)利用RT-PCR方法對(duì)Bmsod3基因的組織表達(dá)情況進(jìn)行了分析,發(fā)現(xiàn)其在中腸和馬氏管中特異表達(dá),且與家蠶組織表達(dá)芯片的數(shù)據(jù)完全一致。RT-PCR分析的誘導(dǎo)表達(dá)模式發(fā)現(xiàn)在NPV誘導(dǎo)后,處理組相對(duì)于對(duì)照組的Bmsod3基因表達(dá)豐度都有所上升。
　　3)隨后我們?cè)O(shè)計(jì)全長(zhǎng)擴(kuò)增引物成功將該基因克隆到Trans-Tsimp

6、le載體上,再將克隆得到的基因重新連接表達(dá)載體上進(jìn)行原核表達(dá),在表達(dá)系統(tǒng)上我們選用了現(xiàn)在應(yīng)用較為成熟的表達(dá)菌株BL21(DE3)和表達(dá)載體pET28(a),pET28(a)上帶有方便對(duì)表達(dá)蛋白進(jìn)行純化的His標(biāo)簽。對(duì)鎳柱進(jìn)行蛋白純化時(shí),當(dāng)洗脫緩沖液中咪唑濃度為300 mM時(shí),目的蛋白開(kāi)始被洗脫出來(lái),但同時(shí)也含有比較多的雜蛋白,500mM的咪唑濃度可以很好地將目的蛋白洗脫,純化得到較單一的目的蛋白,該蛋白可用于進(jìn)行蛋白透析復(fù)性,或進(jìn)一步制