檢測J亞群禽白血病病毒抗體的間接ELISA方法建立和針對gp85蛋白的單克隆抗體研制.pdf

1、J亞群禽白血病病毒(ALV-J)是反轉(zhuǎn)錄病毒科α腫瘤病毒屬的禽白血病病毒/禽肉瘤病病毒群中的一個亞群,由英國學者Payne于1991年在肉雞上發(fā)現(xiàn)。該病毒主要引起雞的髓細胞瘤白血病,給世界上許多國家的養(yǎng)雞業(yè)帶來了巨大的經(jīng)濟損失。ALVJ既可水平傳播,又可垂直傳播。目前,種群凈化是防控J亞群禽白血病的有效措施,因此有必要建立起準確、快速、靈敏的ALV-J檢測技術(shù)。
　　 本研究采用PCR方法克隆出本室分離保存的JS-9-09-Ch

2、株ALV完整的gp85基因,并進行測序,上傳序列獲得GenBank登錄號為:JF911743。分別克隆到pET-32a(+)和pGEX-6P-1載體,構(gòu)建重組質(zhì)粒pET-32a(+)-gp85和pGEX-6P-1-gp85。將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌,以IPTG誘導表達gp85融合蛋白。表達的融合蛋白分別用High-Affinit),Ni-IDA Resin和High-Affinity GST Resin純化。以His-gp85融合蛋白與等

3、量弗氏完全佐劑乳化后免疫SPF雞,每隔兩周進行加強免疫,制備抗gp85的陽性血清。以GST-gp85包被酶標板、抗gp85陽性血清為一抗,辣根過氧化物酶標記的羊抗雞IgG為二抗,建立起檢測ALV-J gp85抗體的間接ELISA方法。經(jīng)過對反應條件進行優(yōu)化,確定GST-gp85最佳包被濃度為0.05μg/孔,陽性血清的稀釋倍數(shù)為1:500,血清作用時間為60 min。
　　 將純化的GST-gp85融合蛋白用等量的弗氏完全佐劑乳

4、化,皮下多點免疫6周齡BALB/c小鼠,免疫劑量為200μg/只;每隔兩周以相同的方法以弗氏不完全佐劑與抗原乳化后加強免疫,免疫劑量為100μg/只;第四次免疫后兩周,以O(shè)ST-gp85融合蛋白按100μg/只的劑量加強免疫,4 d后取小鼠脾細胞與骨髓瘤細胞SP2/0融合。用純化的His-gp85包被ELISA反應板,間接ELISA法篩選陽性克隆,并對陽性孔采用有限稀釋法進行亞克隆,獲得6株穩(wěn)定分泌抗gp85單克隆抗體的雜交瘤細胞株。以