SNX5蛋白對人流感病毒H1N1感染CHO-K1細胞影響.pdf

1、背景和目的：一直認為，流感病毒感染的初始階段是其外殼上的血凝素（Hemagglutinin,HA）結合到宿主細胞膜上的唾液酸受體再引發(fā)一系列入胞過程，其中包括巨胞飲途徑。而細胞內(nèi)SNX5蛋白又與巨胞飲有關。唾液酸受體的多樣性決定了病毒感染的特異性，人流感病毒結合α-2,6唾液酸受體，可通過植物凝集素SNA染色辨別。而禽流感表達則結合α-2,3唾液酸受體，被植物凝集素MAAI、MAAII染色辨別。人流感病毒能否感染只存在禽流感病毒受體的C

2、HO-K1細胞，以及SNX5是否能夠與巨胞飲介導的病毒感染過程有關還有待確定。因此，本研究將針對這兩個問題進行相關研究。
　　材料與方法：
　　1.唾液酸受體表達研究：將三種植物凝集素SNA、MAAⅠ和MAAⅡ分別與CHO-K1細胞孵育過夜，經(jīng)辣根過氧化物酶標記的鏈霉卵白素結合后，AEC顯色。
　　2.siRNA下調(diào)SNX5效率的檢測：設計RNA干擾序列，將干擾試劑與CHO-K1細胞共孵育一段時間后利用實時定量PCR和

3、免疫蛋白印跡檢測SNX5下調(diào)情況。
　　3.吞噬實驗：將FITC標記的右旋糖酐與SNX5下調(diào)后的CHO-K1細胞共孵育一段時間后利用流式細胞術檢測內(nèi)吞顆粒。
　　4.免疫熒光檢測CHO-K1細胞內(nèi)SNX5蛋白與病毒分布情況：將CHO-K1細胞與SNX5蛋白流感病毒NP蛋白抗體孵育，用已感染的CHO-K1細胞爬片進行免疫熒光檢測，觀察細胞SNX5蛋白與流感病毒在細胞內(nèi)的定位。
　　5.免疫熒光檢測CHO-K1細胞吞噬的F

4、ITC-Dextran與感染的病毒分布情況：在流感病毒感染CHO-K1細胞時同時加入FITC-Dextran，用已感染的CHO-K1細胞爬片進行免疫熒光檢測，觀察細胞吞噬的右旋糖酐與流感病毒在細胞內(nèi)的定位。
　　6.人流感病毒感染CHO-K1細胞：使用的病毒為A/Nanchang/8002/2009(H1N1)，設置不同時間段收取細胞，進行后續(xù)實驗檢測，以了解病毒復制感染情況。
　　7.人流感病毒基因復制檢測：CHO-K1細

5、胞感染后，提取其總RNA，進行反轉(zhuǎn)錄后，進行先提取感染后的CHO-K1細胞總RNA，逆轉(zhuǎn)錄后使用熒光定量PCR的方法檢測人流感病毒保守基因基質(zhì)蛋白M1的表達情況，從而分析CHO-K1細胞內(nèi)流感病毒的復制情況和感染情況。
　　8.人流感病毒蛋白合成檢測：CHO-K1細胞感染后，收取細胞，提取總蛋白，利用免疫印跡的方法檢測感染后的CHO-K1細胞內(nèi)流感病毒核蛋白NP的相對表達量。
　　結果：
　　植物凝集素特異性染色結果顯

6、示，CHO-K1細胞與植物凝集素MAAI和MAAII孵育后，細胞膜表面呈陽性信號，表明CHO-K1細胞膜上存在α-2,3唾液酸受體。但與植物凝集素SNA共孵育后，則呈陰性信號，表明CHO-K1細胞不存在人流感α-2,6唾液酸受體。
　　利用RT-PCR檢測siRNA下調(diào)效率，與對照組相比，siRNA干擾過后的CHO-K1細胞內(nèi)SNX5基因表達量減少約70％。通過流式細胞儀檢測發(fā)現(xiàn)，SNX5下調(diào)后的CHO-K1細胞通過巨胞飲吞噬的右

7、旋糖酐含量下降，說明其吞噬能力減弱。利用人流感病毒感染SNX5下調(diào)后的CHO-K1細胞，再用RT-PCR和免疫印跡檢測病毒基質(zhì)蛋白基因表達量及流感病毒核蛋白，顯示其表達量與對照組有顯著差異。
　　結論：
　　1.CHO-K1細胞膜僅僅存在禽流感病毒α-2,3唾液酸受體，沒有人流感病毒α-2,6唾液酸受體；
　　2.人流感病毒H1N1可以感染缺乏α-2,6唾液酸受體的CHO-K1細胞，并可在細胞內(nèi)復制；
　　3.S