SNX5蛋白對人流感病毒H1N1感染CHO-K1細(xì)胞影響.pdf

1、背景和目的：一直認(rèn)為，流感病毒感染的初始階段是其外殼上的血凝素（Hemagglutinin,HA）結(jié)合到宿主細(xì)胞膜上的唾液酸受體再引發(fā)一系列入胞過程，其中包括巨胞飲途徑。而細(xì)胞內(nèi)SNX5蛋白又與巨胞飲有關(guān)。唾液酸受體的多樣性決定了病毒感染的特異性，人流感病毒結(jié)合α-2,6唾液酸受體，可通過植物凝集素SNA染色辨別。而禽流感表達(dá)則結(jié)合α-2,3唾液酸受體，被植物凝集素MAAI、MAAII染色辨別。人流感病毒能否感染只存在禽流感病毒受體的C

2、HO-K1細(xì)胞，以及SNX5是否能夠與巨胞飲介導(dǎo)的病毒感染過程有關(guān)還有待確定。因此，本研究將針對這兩個問題進(jìn)行相關(guān)研究。
　　材料與方法：
　　1.唾液酸受體表達(dá)研究：將三種植物凝集素SNA、MAAⅠ和MAAⅡ分別與CHO-K1細(xì)胞孵育過夜，經(jīng)辣根過氧化物酶標(biāo)記的鏈霉卵白素結(jié)合后，AEC顯色。
　　2.siRNA下調(diào)SNX5效率的檢測：設(shè)計RNA干擾序列，將干擾試劑與CHO-K1細(xì)胞共孵育一段時間后利用實(shí)時定量PCR和

3、免疫蛋白印跡檢測SNX5下調(diào)情況。
　　3.吞噬實(shí)驗(yàn)：將FITC標(biāo)記的右旋糖酐與SNX5下調(diào)后的CHO-K1細(xì)胞共孵育一段時間后利用流式細(xì)胞術(shù)檢測內(nèi)吞顆粒。
　　4.免疫熒光檢測CHO-K1細(xì)胞內(nèi)SNX5蛋白與病毒分布情況：將CHO-K1細(xì)胞與SNX5蛋白流感病毒NP蛋白抗體孵育，用已感染的CHO-K1細(xì)胞爬片進(jìn)行免疫熒光檢測，觀察細(xì)胞SNX5蛋白與流感病毒在細(xì)胞內(nèi)的定位。
　　5.免疫熒光檢測CHO-K1細(xì)胞吞噬的F

4、ITC-Dextran與感染的病毒分布情況：在流感病毒感染CHO-K1細(xì)胞時同時加入FITC-Dextran，用已感染的CHO-K1細(xì)胞爬片進(jìn)行免疫熒光檢測，觀察細(xì)胞吞噬的右旋糖酐與流感病毒在細(xì)胞內(nèi)的定位。
　　6.人流感病毒感染CHO-K1細(xì)胞：使用的病毒為A/Nanchang/8002/2009(H1N1)，設(shè)置不同時間段收取細(xì)胞，進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)檢測，以了解病毒復(fù)制感染情況。
　　7.人流感病毒基因復(fù)制檢測：CHO-K1細(xì)

5、胞感染后，提取其總RNA，進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄后，進(jìn)行先提取感染后的CHO-K1細(xì)胞總RNA，逆轉(zhuǎn)錄后使用熒光定量PCR的方法檢測人流感病毒保守基因基質(zhì)蛋白M1的表達(dá)情況，從而分析CHO-K1細(xì)胞內(nèi)流感病毒的復(fù)制情況和感染情況。
　　8.人流感病毒蛋白合成檢測：CHO-K1細(xì)胞感染后，收取細(xì)胞，提取總蛋白，利用免疫印跡的方法檢測感染后的CHO-K1細(xì)胞內(nèi)流感病毒核蛋白NP的相對表達(dá)量。
　　結(jié)果：
　　植物凝集素特異性染色結(jié)果顯

6、示，CHO-K1細(xì)胞與植物凝集素MAAI和MAAII孵育后，細(xì)胞膜表面呈陽性信號，表明CHO-K1細(xì)胞膜上存在α-2,3唾液酸受體。但與植物凝集素SNA共孵育后，則呈陰性信號，表明CHO-K1細(xì)胞不存在人流感α-2,6唾液酸受體。
　　利用RT-PCR檢測siRNA下調(diào)效率，與對照組相比，siRNA干擾過后的CHO-K1細(xì)胞內(nèi)SNX5基因表達(dá)量減少約70％。通過流式細(xì)胞儀檢測發(fā)現(xiàn)，SNX5下調(diào)后的CHO-K1細(xì)胞通過巨胞飲吞噬的右

7、旋糖酐含量下降，說明其吞噬能力減弱。利用人流感病毒感染SNX5下調(diào)后的CHO-K1細(xì)胞，再用RT-PCR和免疫印跡檢測病毒基質(zhì)蛋白基因表達(dá)量及流感病毒核蛋白，顯示其表達(dá)量與對照組有顯著差異。
　　結(jié)論：
　　1.CHO-K1細(xì)胞膜僅僅存在禽流感病毒α-2,3唾液酸受體，沒有人流感病毒α-2,6唾液酸受體；
　　2.人流感病毒H1N1可以感染缺乏α-2,6唾液酸受體的CHO-K1細(xì)胞，并可在細(xì)胞內(nèi)復(fù)制；
　　3.S