抗H5N1亞型流感病毒的寡核苷酸藥物篩選及其活性研究.pdf

1、本文以中國大陸分離的人H5N1亞型高致病性禽流感病毒作為研究對象，分別篩選出針對該病毒膜蛋白和內部蛋白的寡核苷酸藥物，并檢測了其抗病毒活性，以期為研制新型抗流感病毒藥物提供新的思路。全文包括三個部分： 一、H5N1亞型流感病毒血凝素的序列分析及其在大腸桿菌的表達與純化。 首先，利用RT-PCR技術，擴增得到中國大陸分離的首例人H5N1亞型禽流感病毒的血凝素基因，然后對推導的氨基酸序列進行了生物信息學分析?？乖砦环治霰砻?/p>

2、，該蛋白含有23個可能的抗原表位，其中17個抗原表位位于HA1亞單位；N-糖基化分析發(fā)現HA含有7個糖基化位點，其中5個位于HAl亞單位；對16株分離自不同年代、地區(qū)和不同宿主的H5N1亞型高致病性禽流感病毒的血凝素蛋白進行同源序列比較，發(fā)現其受體結合區(qū)保持了相對的穩(wěn)定性，裂解位點鄰近的氨基酸序列為PLRERRRKR，符合高致病性禽流感病毒的特征；利用同源建模的方法，分析了A/Hong Kong/156/97(H5N1)和A/Anhui

3、/1/2005(H5N1)的HA1三級結構，發(fā)現二者具有相當大的相似性，這就為基于結構進行的核酸藥物研究奠定了基礎。進而將去除信號肽序列的HA1克隆至原核表達載體pQE-80L，轉化大腸桿菌后用IPTG誘導表達，結果發(fā)現HA1以包涵體形式表達，表達量達30％以上。將此包涵體變性裂解后過鎳離子親和柱純化，SDS-PAGE分析蛋白純度達90％以上；Western-blot結果顯示表達的蛋白大小約為37kD，并具有良好的免疫原性。我們隨后大量

4、制備了HA1蛋白，免疫小鼠，得到了高效價的鼠源HA1多克隆抗體。 二、抗H5Nl亞型流感病毒血凝素蛋白的DNA適配子篩選及其活性鑒定。 在獲得純化的HA1蛋白的基礎上，應用SELEX技術篩選針對該蛋白的DNA適配子。合成了79個堿基的單鏈DNA文庫，其兩端序列固定、中間為40個堿基的隨機序列。將其與靶蛋白孵育，利用靶蛋白帶His標簽的特性，將蛋白-核酸復合物過鎳離子親和柱，采用含100mM咪唑的洗脫液將特異性結合的復合物

5、洗脫下來。隨后以此為模板，以生物素標記的引物進行PCR擴增，擴增產物經熱變性后產生的單鏈DNA庫投入下一輪篩選。如此反復篩選11輪，將每輪篩選產物以HA結合法分析隨機DNA文庫的富集程度。結果顯示，單鏈DNA庫與靶蛋白的親和性逐漸升高，到第9輪后就不再上升。將第11輪的篩選產物PCR擴增后克隆至pGEM-Teasy載體，通過藍白斑篩選隨機挑選80個克隆。從中選擇25個克隆測定DNA序列，分析了其二級結構并測定了HA結合活性。發(fā)現它們分為

6、三個不同的家族(family)，其中第Ⅲ家族的10號適配子(A10)結合活力最強。進一步比較該適配子對HA1蛋白和全病毒的親和性，發(fā)現其對后者親和力更強。然后，大量化學合成適配子A10和A05，在流感病毒感染的MDCK細胞上進行抗病毒活性檢測。發(fā)現用75pmol或100pmol的適配子A10處理后，病毒滴度顯著下降，而細胞活力增強。證明所篩選的DNA適配子可在體外有效地抑制H5N1亞型流感病毒復制。 三、靶向A型流感病毒內部基因

7、的siRNA篩選及其活性鑒定。根據H5N1和H1N1亞型流感病毒的PB1、PA、NP和NS四個內部蛋白編碼基因的同源性序列，設計了四條針對不同基因的21nt siRNA，并以A/CNIC/246/2000(H1N1)(簡稱“246毒株”)作為模式病毒，進行抗病毒試驗。首先比較了不同細胞對246毒株的敏感性。隨后選擇A549作為宿主細胞，對轉染條件進行了摸索。流式細胞術和熒光顯微鏡檢測顯示Hiperfect/siRNA比為3μl：5nM時

8、、siRNA劑量為50nM時就可導致基因沉默。在此基礎上，我們將這四種siRNA分別轉染A549細胞，然后接種流感病毒，在不同時段檢測siRNA抑制病毒的效果。結果表明，與轉染對照siRNA組相比，四種siRNA轉染的細胞呈現不同程度的病毒抑制。分析各組的病毒滴度、RNA拷貝數及蛋白質水平的變化，發(fā)現RNAi抑制病毒效果最好的依次是：siNP、siPB1、siNS、siPA。流式細胞術和熒光顯微鏡分析結果顯示，針對PB1的siRNA可抑

9、制病毒引起的細胞凋亡。進而檢測了siRNA在雞胚抑制病毒的活性。將這四種siRNA分別接種雞胚，同時接種流感病毒。培養(yǎng)17hr后取雞胚尿囊液檢測發(fā)現，它們對流感病毒的抑制效果與體外實驗結果一致。說明我們設計的siRNA可以有效抑制流感病毒的復制，有望應用于控制流感病毒感染。 綜上所述，本研究首次篩選到針對人H5N1亞型禽流感病毒血凝素蛋白的DNA適配子，并證明其在體外有抗病毒活性；本研究還首次報導針對流感病毒NP尾部編碼基因和P