縮宮素對(duì)肥大細(xì)胞脫顆粒和DRG神經(jīng)元興奮性的影響及其機(jī)制研究.pdf

1、疼痛影響人們生活的各個(gè)方面，雖然現(xiàn)代醫(yī)學(xué)取得巨大進(jìn)步，但是許多慢性痛仍然是醫(yī)學(xué)所面臨的重大挑戰(zhàn)。在消化系統(tǒng)中，內(nèi)臟慢性痛主要見于功能性腸病（例如，慢性特發(fā)性消化不良，功能性腹痛，腸易激綜合癥等），其中最常見于腸易激綜合癥（irritable bowel syndrome，IBS）。目前對(duì)內(nèi)臟痛的研究發(fā)現(xiàn)，中樞和外周機(jī)制均起重要作用。中樞神經(jīng)系統(tǒng)中，腦腸軸機(jī)制越來越凸顯;在外周，免疫機(jī)制以及神經(jīng)-免疫關(guān)聯(lián)在內(nèi)臟痛發(fā)生中發(fā)揮重要的作用。

2、r>　　縮宮素(oxytocin，OT)是由九個(gè)氨基酸組成的神經(jīng)肽，主要由下丘腦的室旁核和視上核合成。OT在臨床上主要用于引產(chǎn)、催產(chǎn)、產(chǎn)后出血以及促排乳。近些年研究表明，OT及縮宮素受體(oxytocin receptor，OTR)在腸道中表達(dá)，而且在腸道運(yùn)動(dòng)和感覺，腸道炎癥的調(diào)節(jié)，腸粘膜結(jié)構(gòu)功能的維持等方面發(fā)揮重要的作用。越來越多的研究證實(shí)，在外周器官應(yīng)用OT（靜脈注射、腹腔注射、皮下注射以及結(jié)腸灌注），能顯著抑制內(nèi)臟痛的發(fā)生。深入研

3、究OT對(duì)內(nèi)臟痛的作用及其機(jī)制，可為預(yù)防和治療內(nèi)臟痛提供新的方法和依據(jù)。本研究主要從免疫和神經(jīng)兩方面探討OT的外周鎮(zhèn)痛機(jī)制。
　　第一部分 縮宮素對(duì)結(jié)腸高敏感大鼠肥大細(xì)胞脫顆粒的影響及其機(jī)制研究
　　目的：
　　已有文獻(xiàn)報(bào)道，OT和OTR在腸道中表達(dá)，OT能顯著抑制內(nèi)臟痛及內(nèi)臟高敏感的發(fā)生。然而，機(jī)制尚不明確。研究發(fā)現(xiàn)，IBS患者腹痛的嚴(yán)重程度及頻率與結(jié)腸神經(jīng)周圍的肥大細(xì)胞數(shù)目有關(guān)，而且肥大細(xì)胞激活通過脫顆粒并釋放炎性介

4、質(zhì)，增強(qiáng)腸神經(jīng)以及背根神經(jīng)節(jié)(dorsal root ganglion，DRG)神經(jīng)元的興奮性，從而導(dǎo)致內(nèi)臟高敏感。本研究的目的是探討OT對(duì)肥大細(xì)胞脫顆粒的作用及其機(jī)制，以期揭示OT抑制內(nèi)臟痛的外周免疫機(jī)制。
　　方法：
　　通過免疫熒光實(shí)驗(yàn)和蛋白免疫印跡(Western Blot)實(shí)驗(yàn)，檢測(cè)OTR在肥大細(xì)胞的表達(dá)。給予大鼠結(jié)腸灌注三硝基苯磺酸(2,4,6-trinitrobenzene sulfonic acid，TNBS

5、)，來誘導(dǎo)結(jié)腸高敏感動(dòng)物模型，采取結(jié)腸灌注OT的方法研究OT對(duì)結(jié)腸高敏感大鼠的作用。使用甲苯胺藍(lán)標(biāo)記大鼠結(jié)腸組織切片中的肥大細(xì)胞，觀察肥大細(xì)胞的數(shù)目和脫顆粒情況。肥大細(xì)胞激活后釋放的組胺含量通過酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定(enzyme linked immunosorbent assay，ELISA)試劑盒進(jìn)行測(cè)定。運(yùn)用全細(xì)胞膜片鉗技術(shù)記錄肥大細(xì)胞的膜離子流。通過鈣成像設(shè)備檢測(cè)肥大細(xì)胞內(nèi)鈣離子Ca2+的變化。
　　結(jié)果：
　　1.OT

6、R在肥大細(xì)胞上的表達(dá)
　　免疫熒光實(shí)驗(yàn)證實(shí)，OTR在人和大鼠結(jié)腸組織的肥大細(xì)胞上表達(dá)。潰瘍性結(jié)腸炎患者以及TNBS誘導(dǎo)的內(nèi)臟高敏感模型大鼠的結(jié)腸組織中OTR表達(dá)陽(yáng)性的肥大細(xì)胞比例均顯著升高。OTR也表達(dá)于人肥大細(xì)胞株-1(human mast cellline-1,HMC-1)和小鼠肥大細(xì)胞瘤細(xì)胞株(mouse mastocytoma cell line，P815)。
　　2.OT對(duì)肥大細(xì)胞脫顆粒的影響
　　OT能顯著

7、抑制TNBS誘導(dǎo)的結(jié)腸高敏感模型大鼠結(jié)腸肥大細(xì)胞脫顆粒。經(jīng)OT灌腸的TNBS模型大鼠結(jié)腸切片中脫顆粒肥大細(xì)胞的百分?jǐn)?shù)(53.5％，38/71)，顯著低于TNBS模型大鼠(81.9％，59/72)。
　　3.OT對(duì)肥大細(xì)胞脫顆粒時(shí)釋放組胺的影響
　　采用化合物48/80(compound48/80，C48/80)誘導(dǎo)P815細(xì)胞脫顆粒，釋放組胺，10-6 M OT預(yù)處理細(xì)胞后，C48/80誘導(dǎo)P815細(xì)胞釋放組胺的含量明顯降低

8、。
　　4.OT對(duì)肥大細(xì)胞內(nèi)向電流的影響
　　用全細(xì)胞膜片鉗記錄的方法來測(cè)定OT對(duì)C48/80誘導(dǎo)HMC-1細(xì)胞和P815細(xì)胞產(chǎn)生內(nèi)向電流的作用。在電壓鉗模式下，細(xì)胞被鉗制在-60 mV，用C48/80持續(xù)作用HMC-1細(xì)胞或者P815細(xì)胞，兩種細(xì)胞均產(chǎn)生明顯的內(nèi)向電流。OT預(yù)處理兩種細(xì)胞后，C48/80誘導(dǎo)細(xì)胞產(chǎn)生的內(nèi)向電流均明顯減小。
　　5.OTR拮抗劑和一氧化氮合酶(nitric oxide synthase，

9、NOS)抑制劑對(duì)OT作用的影響
　　用OTR的阻斷劑阿托西班(atosiban)或者非選擇性NOS抑制劑NG-Methyl-L-arginine acetate salt(L-NMMA)預(yù)處理后，OT對(duì)C48/80誘導(dǎo)P815細(xì)胞組胺釋放的抑制作用被顯著逆轉(zhuǎn)，OT對(duì)C48/80誘導(dǎo)HMC-1細(xì)胞和P815細(xì)胞內(nèi)向電流的抑制作用同樣被顯著逆轉(zhuǎn)。
　　6.OT對(duì)肥大細(xì)胞內(nèi)鈣離子的影響
　　用Fura-2作為鈣離子的熒光染料

10、，用鈣成像設(shè)備分別記錄340nm和380nm激發(fā)出的發(fā)射光強(qiáng)度值F340和F380，以F340/F380的比值來體現(xiàn)胞內(nèi)鈣離子的水平。不同濃度的OT作用HMC-1細(xì)胞或者P815細(xì)胞后，細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度呈劑量依賴性增高。
　　結(jié)論：
　　1.肥大細(xì)胞上表達(dá)OTR，潰瘍性結(jié)腸炎患者以及TNBS誘導(dǎo)的結(jié)腸高敏感模型大鼠的結(jié)腸組織中表達(dá)OTR的肥大細(xì)胞比例均顯著增高。
　　2.外源性O(shè)T可抑制結(jié)腸高敏感大鼠的結(jié)腸肥大細(xì)胞脫顆

11、粒，進(jìn)而發(fā)揮對(duì)結(jié)腸高敏感性的抑制作用。
　　3.外源性O(shè)T可能通過Ca2+-NOS信號(hào)通路抑制肥大細(xì)胞脫顆粒。
　　第二部分 縮宮素對(duì)正常大鼠背根神經(jīng)節(jié)神經(jīng)元興奮性的影響及其機(jī)制研究
　　目的：
　　OT在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中發(fā)揮著重要的鎮(zhèn)痛作用。然而，OT在外周的鎮(zhèn)痛作用雖然也有報(bào)道，但機(jī)制不清。本研究的目的是探討OT對(duì)DRG神經(jīng)元電生理特性的影響，以期揭示OT鎮(zhèn)痛的外周神經(jīng)系統(tǒng)機(jī)制。
　　方法：
　　急

12、性分離DRG神經(jīng)元并培養(yǎng)。通過鈣離子成像技術(shù)，檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)鈣離子的變化。運(yùn)用全細(xì)胞膜片鉗技術(shù)，記錄DRG神經(jīng)元的電生理特性。免疫熒光實(shí)驗(yàn)用于檢測(cè)OTR和神經(jīng)型一氧化氮合成酶(neuronal nitric oxide synthase，nNOS)在DRG神經(jīng)元中的表達(dá)及分布。采用免疫熒光實(shí)驗(yàn)和硝酸還原酶法檢測(cè)DRG神經(jīng)元內(nèi)一氧化氮(nitric oxide，NO)的含量。
　　結(jié)果：
　　1.OT對(duì)DRG神經(jīng)元興奮性的影響

13、r>　　OT能夠明顯降低小型DRG神經(jīng)元(直徑20-27μM)的興奮性，這可能跟OT使外向電流增大，引起細(xì)胞膜超極化有關(guān)。OT作用小型DRG神經(jīng)元后，能夠引發(fā)動(dòng)作電位的閾刺激強(qiáng)度顯著增大，而且同等強(qiáng)度的刺激下（正常情況下2倍或者3倍閾刺激強(qiáng)度）引發(fā)動(dòng)作電位的數(shù)量明顯減少。此外，OT可使電壓誘導(dǎo)的外向電流顯著增大，并可引起細(xì)胞膜超極化。
　　2.nNOS抑制劑對(duì)OT引起DRG神經(jīng)元超極化的影響
　　用選擇性的nNOS抑制劑N-

14、Propyl-L-arginine(NPLA)預(yù)處理細(xì)胞，可以明顯降低OT引起的DRG神經(jīng)元超極化。
　　3.OT對(duì)DRG神經(jīng)元胞內(nèi)NO含量的影響
　　免疫熒光和硝酸還原酶法監(jiān)測(cè)NO的方法均顯示，OT能夠顯著提高大鼠急性分離的DRG神經(jīng)元和DRG組織內(nèi)NO含量。用選擇性的nNOS抑制劑NPLA預(yù)處理細(xì)胞，可以明顯逆轉(zhuǎn)OT引起的大鼠DRG組織內(nèi)和急性分離的DRG神經(jīng)元胞內(nèi)NO含量的升高。
　　4.OTR和nNOS在痛覺相

15、關(guān)性DRG神經(jīng)元上共表達(dá)
　　免疫熒光實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，大于85％ IB4標(biāo)記的痛覺相關(guān)性神經(jīng)元上，同時(shí)表達(dá)OTR和nNOS。
　　5.三磷酸腺苷敏感性鉀通道(adenosine triphosphate sensitive potassiumchannel, KATP)的阻斷劑對(duì)OT電生理作用的影響
　　KATP的阻斷劑格列本脲(glibenclamide)明顯減弱OT引起的大鼠DRG神經(jīng)元超極化和外向電流增大的效應(yīng)。