三種細(xì)胞用于建立體外肥大細(xì)胞脫顆粒模型的比較研究.pdf

1、中藥注射劑是我國特有的中藥劑型，是中藥應(yīng)對急癥重癥的重要手段，它是以中醫(yī)藥理論為指導(dǎo)，采用現(xiàn)代科學(xué)技術(shù)和方法，將從中藥或天然藥物的單方或復(fù)方中提取的有效物質(zhì)制成無菌溶液、混懸液或臨用前配成溶液的滅菌粉末供注入體內(nèi)的制劑。中藥注射劑是傳統(tǒng)中醫(yī)藥在現(xiàn)代發(fā)展的經(jīng)典之作，它一改中藥傳統(tǒng)的給藥方式，不經(jīng)過胃腸道，直接進(jìn)入血液，起效迅速，尤其適于急癥重癥。這種給藥方式劑量準(zhǔn)確并且不受消化系統(tǒng)及食物影響，臨床上常用于神昏、抽搐、痙攣，或患消化系統(tǒng)障礙

2、的患者，有著確切的臨床療效。
　　 近些年來，隨著中藥注射劑應(yīng)用的不斷擴(kuò)大，臨床不良反應(yīng)的相關(guān)報道數(shù)量也呈上升趨勢，其主要不良反應(yīng)包括皮膚及粘膜損害、呼吸系統(tǒng)損害、心血管系統(tǒng)損害及藥物熱等。同時一種癥狀類似于過敏反應(yīng)的不良反應(yīng)也時有發(fā)生，它與經(jīng)典的過敏反應(yīng)不同之處在于，經(jīng)典途徑的過敏反應(yīng)過敏原首次進(jìn)入機(jī)體后，致敏機(jī)體產(chǎn)生特異性的IgE，當(dāng)過敏原再次刺激機(jī)體時，被特異性地識別，并與抗體發(fā)生反應(yīng)，導(dǎo)致機(jī)體肥大細(xì)胞、嗜堿性粒細(xì)胞脫顆粒

3、，釋放大量生物活性物質(zhì)，繼而引發(fā)一系列免疫效應(yīng);而類過敏反應(yīng)的發(fā)生，不需預(yù)先接觸抗原物質(zhì)，也無特異性IgE參與，因其臨床癥狀與過敏反應(yīng)相似而得名，但準(zhǔn)確機(jī)制尚不明確。
　　 然而，針對注射劑的過敏反應(yīng)，《中國藥典》(2010版)僅收錄豚鼠主動全身過敏試驗(ASA)和被動皮膚過敏試驗(PCA)兩項。豚鼠易于致敏，曾是理想的過敏試驗對象，常規(guī)的過敏試驗也多采用豚鼠作為模型。但由于豚鼠個體較小時行為改變不夠典型和明確，加之行為學(xué)觀察本

4、身也存在較多主觀因素，使得豚鼠試驗容易出現(xiàn)假陽性或假陰性的結(jié)果。另外豚鼠的全身主動過敏試驗和被動皮膚過敏試驗主要針對依賴IgE介導(dǎo)的經(jīng)典途徑過敏反應(yīng)，檢測效果確切，但中藥注射劑常引發(fā)類過敏反應(yīng)，豚鼠試驗的檢測效果并不理想，常出現(xiàn)漏篩的現(xiàn)象，這也是導(dǎo)致中藥注射劑過敏反應(yīng)頻發(fā)的原因之一。
　　 因此，尋找針對中藥注射劑所引發(fā)類過敏反應(yīng)的篩查模型是控制中藥注射劑用藥安全的重要舉措。本文將從體外細(xì)胞模型著手，篩選出最適宜的針對性強(qiáng)的類過

5、敏反應(yīng)體外篩查模型，作為中藥注射劑應(yīng)用于臨床前的安全性檢查，或作為篩查中藥注射劑中致敏成分的篩查模型，給中藥注射劑的安全使用和二次開發(fā)奠定基礎(chǔ)。
　　 目的:
　　 1、在常用的肥大細(xì)胞及嗜堿性粒細(xì)胞系中篩選出一種最適合作為中藥注射劑引發(fā)類過敏反應(yīng)體外篩查模型的細(xì)胞系。
　　 2、利用臨床常用的幾種中藥注射劑，評價所篩選出的細(xì)胞系與臨床的符合率。
　　 方法:
　　 1.測定細(xì)胞生長曲線:

6、　　 取對數(shù)生長的三種細(xì)胞，按不同濃度接種于96孔板中，分別用MTT法與CCK-8法測定培養(yǎng)0d，1d，2d，3d，4d，5d的細(xì)胞活力，每個時間點，每種細(xì)胞，每個濃度6個復(fù)孔。其中MTT組每孔加入10μL濃度為5mg/mL的MTT溶液，孵育4h后吸棄培養(yǎng)液，加入DMSO溶液震蕩溶解，酶標(biāo)儀570nm處測定各孔的吸光度;CCK-8組每孔加入10μL CCK-8溶液，培養(yǎng)1h后，酶標(biāo)儀450nm測定各孔的。測得吸光度利用SPSS13.0

7、計算均數(shù)及方差，分別對不同濃度的不同種類細(xì)胞利用Office Excel2010對所求得的吸光度均數(shù)和培養(yǎng)時間繪制生長曲線。
　　 2.篩選用于建立體外肥大細(xì)胞脫顆粒模型的細(xì)胞系
　　 2.1.組胺釋放量測定
　　 分別取對數(shù)生長期的三種細(xì)胞，接種于24孔板中，生長48h后，棄去培養(yǎng)基，加入Tyrode液培養(yǎng)條件下平衡10分鐘。實驗組加入50μL C48/80，并設(shè)置空白對照組加入等體積Tyrode液。分別反應(yīng)0

8、min，15min，30min，45min和60min后終止反應(yīng)。于0-4℃以2000r/min離心10min，取上清液備用。Ku812直接以平板離心機(jī)相同轉(zhuǎn)速離心取上清液備用。
　　 2.2.高效液相色譜-質(zhì)譜(LC-MS)法測定組胺含量
　　 C18固相萃取小柱活化后上樣，以0.2％氨水3mL沖洗，再加入3mL甲醇，收集甲醇液，室溫下氮氣吹干，加入0.5mL甲醇充分溶解后，過0.22μm濾膜備用。色譜條件:流動相為乙

9、腈:加入0.3％甲酸的0.5mmol/L醋酸銨水溶液(60(∶)40);色譜柱:Alltima Phenyl C18柱(250mm×4.6mm，5μm);流速:0.8mL/min;柱溫:35℃。用Office Excel2010軟件，以不同組胺標(biāo)準(zhǔn)品峰面積積分對濃度進(jìn)行線性回歸計算，得出標(biāo)準(zhǔn)曲線方程后計算各樣品組胺含量。
　　 2.3.氨基糖苷酶凈釋放度測定
　　 分別取對數(shù)生長期的三種細(xì)胞，接種于96孔酶標(biāo)板中，加入5

10、0μL底物，生長48h后實驗組每孔加入50μL C48/80;氨基糖苷酶總含量對照組加入50μL0.3％TritonX-100細(xì)胞裂解液，將全部膜裂解，釋放所有的氨基糖苷酶，作為氨基糖苷酶總含量對照組;空白組加入等量Tyrode液。分別反應(yīng)0min，15min，30min，45 min，60min后加入150μL終止液終止反應(yīng)，酶標(biāo)儀測定405nm處各孔反應(yīng)液的吸光度，結(jié)果扣除空白對照后，以實驗組即C48/80刺激組吸光度與氨基糖苷酶總

11、含量對照組裂解全部膜后的吸光對之比，衡量實驗組C48/80刺激后氨基糖苷酶的釋放度。
　　 2.4.脫顆粒百分率
　　 分別取對數(shù)生長期的三種細(xì)胞，接種于24孔板中。生長48h后，棄去培養(yǎng)基加入Tyrode液，平衡10分鐘。實驗組加入50μL C48/80刺激，并設(shè)置空白對照組加入等量Tyrode液。分別于0min，15min，30min，45min和60min終止反應(yīng)并以中性紅染色。隨機(jī)計數(shù)100個細(xì)胞中脫顆粒細(xì)胞的個

12、數(shù)，計算出脫顆粒百分率。
　　 以上結(jié)果以SPSS13.0統(tǒng)計軟件析因設(shè)計方差分析。其中組胺測定時的峰面積積分對濃度進(jìn)行的線性回歸計算，使用Office Excel2010。
　　 3.幾種常見中藥注射劑對P815細(xì)胞脫顆粒的影響
　　 3.1.檢測幾種常用中藥注射液對P815細(xì)胞的IC50濃度
　　 中藥注射劑樣品以制劑原液為母液，稀釋為一定濃度梯度，共設(shè)置連同母液在內(nèi)的6個濃度，實驗依次設(shè)空白對照組，

13、6個濃度的注射劑組，每組設(shè)6個復(fù)孔。取對數(shù)期生長的P815細(xì)胞接種于96孔板中，培養(yǎng)12h后，空白對照組加入50μL培養(yǎng)液，注射劑組加入50μL不同濃度中藥注射劑，繼續(xù)培養(yǎng)36h，每孔加入室溫平衡過的MTT溶液，相同條件下孵育4h，吸棄培養(yǎng)液，另加入DMSO震蕩溶解，測定各孔的吸光度，以SPSS13.0計算各注射劑品種各濃度吸光度均數(shù)，依照改良寇式法計算IC50。每種注射劑平行測定三次利用SPSS13.0取平均值。
　　 3.2

14、.幾種常見中藥注射劑對P815細(xì)胞脫顆粒的影響
　　 以篩選建立體外肥大細(xì)胞脫顆粒模型的相同方法檢測各種中藥注射劑在其IC50濃度下對P815細(xì)胞刺激60min后的組胺釋放量，氨基糖苷酶凈釋放度和細(xì)胞脫顆粒率三項指標(biāo)。實驗過程中設(shè)置以C48/80刺激的陽性對照組和以Tyrode刺激的陰性對照組。結(jié)果以SPSS13.0統(tǒng)計軟件One Way Anova方法分析。
　　 結(jié)果:
　　 1.測定細(xì)胞生長曲線:
　

15、　 MTT法和CCK-8所測定的同種細(xì)胞的生長曲線趨勢基本相同，測定結(jié)果得出RBL-2H3細(xì)胞在0.8×105個/mL-1.0×105個/mL范圍內(nèi)，P815細(xì)胞在0.5×105個/mL-0.8×105個/mL范圍內(nèi)，Ku812細(xì)胞在0.8×105個/mL-1.0×105個/mL范圍內(nèi)生長曲線有明顯的指數(shù)生長期和平臺期，沒有明顯的潛伏期，并且48h左右能夠進(jìn)入或接近平臺期。細(xì)胞在該濃度下，適宜進(jìn)行本文后續(xù)的其他實驗。
　　 2

16、.篩選用于建立體外肥大細(xì)胞脫顆粒模型的細(xì)胞系
　　 C48/80刺激后0-60min，三細(xì)胞系過敏活性物質(zhì)釋放均有明顯增加，以析因設(shè)計方差分析的方法統(tǒng)計后，根據(jù)交互效應(yīng)輪廓圖可見，在相同刺激條件下，P815的組胺釋放量，細(xì)胞脫顆粒率和氨基糖苷酶凈釋放度三項指標(biāo)的突增均明顯較其他兩種細(xì)胞系發(fā)生時間早，突增效果明顯。Ku812為懸浮細(xì)胞，細(xì)胞脫顆粒狀況不宜觀察，其結(jié)果只作為Ku812在各刺激時間點之間的比較，與同刺激時間點的其他兩種

17、細(xì)胞無可比性，這也可說明Ku812在細(xì)胞脫顆粒項目下，不利于實驗觀察。
　　 關(guān)于作用時間，根據(jù)臨床報道，類過敏反應(yīng)常發(fā)生在注射給藥后60min內(nèi)發(fā)生，將P815細(xì)胞的各項指標(biāo)相鄰兩個時間點兩兩比較，根據(jù)交互效應(yīng)輪廓圖，選擇60min為刺激時間。
　　 3.幾種常見中藥注射劑對P815細(xì)胞脫顆粒的影響
　　 在被檢測的十二種注射劑中，血栓通注射液、清開靈注射液、雙黃連粉針劑及水針劑、香丹注射液、腫節(jié)風(fēng)注射液、膽木

18、注射液、丹參注射液、苦參堿注射液在三項指標(biāo)的檢測中與陰性對照組相比均有明顯的統(tǒng)計學(xué)差異，即P＜0.05，提示上述注射劑品種對P815細(xì)胞有較強(qiáng)的致敏性;相對而言，柴胡注射液、銀杏提取物注射液、生脈注射液三項檢測指標(biāo)與陰性對照組差異不顯著，提示上述三種注射劑對P815細(xì)胞的致敏性相對較弱。
　　 結(jié)論:
　　 以在P815、RBL-2H3、Ku812三種肥大細(xì)胞和嗜堿性粒細(xì)胞的細(xì)胞系中，以P815細(xì)胞系最適宜作為中藥注射劑

19、引發(fā)類過敏反應(yīng)體外篩查模型。P815細(xì)胞在C48/80刺激下，表現(xiàn)出顯著的脫顆粒反應(yīng)，且反應(yīng)結(jié)果易被量化檢測，重復(fù)性較好。在幾種常見中藥注射劑刺激下，以本實驗設(shè)計的檢測方法測定，引起細(xì)胞脫顆粒程度與國家食品藥品監(jiān)督管理局的官方公示和《藥物不良反應(yīng)通報》中所述的中藥注射劑不良反應(yīng)發(fā)生情況吻合度較高。P815細(xì)胞在臨床報道致敏性較高的中藥注射劑刺激下，所測得指標(biāo)結(jié)果與陰性對照差異明顯;同時在臨床報道致敏性不明顯的中藥注射劑刺激下，所測得指標(biāo)