肥大細胞在細菌性腹瀉中的作用機制研究.pdf

1、腹瀉的發(fā)病機制早已得到廣泛討論，但其確切機制仍需要深入研究。事實上，腸上皮細胞對大量細菌及其成分已產(chǎn)生耐受性，但是微生物產(chǎn)物是如何打破這種已建立的耐受并誘發(fā)腹瀉和其它炎癥發(fā)生的仍然不很清楚。
　　 肥大細胞位于宿主和外環(huán)境的表面如皮膚、呼吸道和腸道。肥大細胞被認為是宿主抵御細菌感染的關(guān)鍵物質(zhì)。但是，微生物產(chǎn)物誘導肥大細胞介質(zhì)釋放從而導致腹瀉的機理尚不清楚。
　　 金黃色葡萄球菌（Staphvlococcus aureus

2、，S.aureus）是感染性腹瀉的病因之一。肽聚糖（Peptidoglycan，PGN）是幾乎所有G+和G-菌的細胞壁成分，具有很強的免疫活性，它能夠改變免疫細胞的功能。并可能在細菌性腹瀉中起關(guān)鍵作用。本研究的目的：1） PGN對T84細胞單層（人類腸上皮細胞系）屏障功能的影響；2）肥大細胞對T84屏障功能的影響；3）肥大細胞系對PGN吸收途徑；4）口服PGN誘發(fā)小鼠腹瀉模型的建立；5） TLR2（Toll-like receptor，

3、TLR）和NODs（Nucleotide-binding oligomerization domain，NOD）在介導PGN誘發(fā)的腸道肥大細胞激活過程中的意義；6）肥大細胞激活在PGN誘導的腹瀉中的必要性。
　　 實驗方法:
　　 1.細胞培養(yǎng)和T84細胞單層功能的檢測
　　 本實驗采用T84.細胞單層（T84 Monolayer）細胞。為了評估T84細胞單層轉(zhuǎn)運PGN，我們把來自金黃色葡萄球菌的純化的PGN及H

4、RP（Horseradish peroxidase，HRP）加入到細胞跨膜培養(yǎng)系統(tǒng)中。采用ELISA的方法檢測樣本中的PGN、HRP。HRP流量作為評價T84細胞單層的通透性指標。
　　 2.人肥大細胞系HMC-1、人單核細胞系THP-1、人中腎上皮細胞系HEK293吸收和轉(zhuǎn)運PGN的檢測
　　 T84細胞單層和HMC-1（THP-1、HEK293）共同培養(yǎng)于細胞跨膜培養(yǎng)系統(tǒng)中，然后加入PGN至腸腔側(cè)中，2h后收集細胞。

5、細胞蛋白提取后用Western-Blot的方法檢測細胞中的PGN成分。一部分細胞用冷的丙酮固定后，用抗PGN單克隆抗體及熒光標記的兔抗鼠Ⅱ抗孵育，共聚焦顯微鏡觀察。
　　 3.組織胺分析
　　 用ELISA試劑盒檢測MHC-1（THP-1、HEK293）、小鼠結(jié)腸粘膜肥大細胞及P815細胞（小鼠肥大細胞系）5-HT（5-羥色胺）和組織胺水平。
　　 4.已敲除HMC-1細胞中TLR2和NOD2的表達
　　

6、 RNAi技術(shù)用于檢測已敲除HMC-1細胞中TLR2和NOD2的表達。siRNA轉(zhuǎn)染的效果通過RT-PCR和Western-Blot的方法檢測。
　　 5. PGN誘發(fā)的鼠類腹瀉動物模型
　　 用純化的PGN不同劑量溶于生理鹽水中灌胃，灌胃前用肥大細胞對抗物預處理。計算每只小鼠糞便中含水的百分比。記錄每只小鼠的小腸、大腸濕重及體重。小腸和大腸占體重的比率作為評估腸道液體的指標。
　　 6.P815細胞TLR2、N

7、OD1的表達
　　 免疫細胞化學、Western-Blot方法觀察P815細胞TLR2、NOD1的表達情況。
　　 7.免疫染色
　　 共聚焦顯微鏡觀察造型小鼠腸粘膜肥大細胞及P815細胞TLR2、NOD（1 or2）的表達。
　　 8.肥大細胞重建
　　 培養(yǎng)的肥大細胞（純度>95％）以30，000，40，000，和50，000個細胞/只的劑量通過尾靜脈注射到肥大細胞缺如小鼠（W/Wv）體內(nèi)1月

8、后用于重復口服PGN實驗。
　　 統(tǒng)計學處理:
　　 采用SPSS10.0軟件對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析。所有數(shù)據(jù)均以X±SD表示，組間差異用t檢驗檢測，三組及三組以上的組間比較用方差分析，P<0.05認為差異具有顯著性。
　　 結(jié)果:
　　 1.把PGN加入細胞跨膜培養(yǎng)系統(tǒng)的腸腔側(cè)，把T84單層的TER（Transepithelial electric resistance，TER）和T84對HRP的通透性作為

9、檢測屏障功能的指標。結(jié)果表明，只加PGN并不降低T84細胞單層的TER和通透性，與對照組相比沒有明顯差異。說明PGN并不直接破壞腸粘膜屏障。
　　 2.把融合的T84細胞和HMC-1共同培養(yǎng)在細胞跨膜培養(yǎng)系統(tǒng)中。在加入PGN到腸腔側(cè)2h后，培養(yǎng)基中組織胺的釋放量的增加呈劑量依賴性，電鏡結(jié)果表明肥大細胞廣泛脫顆粒。T84細胞單層的TER在PGN刺激后明顯降低，并且在肥大細胞穩(wěn)定劑預處理后明顯得到抑制。由此證實T84細胞轉(zhuǎn)運的PGN

10、是通過激活HMC-1而完成的。
　　 3.為了證明TLR2介導PGN在肥大細胞中的吸收，把HMC-1培養(yǎng)在含有或不含有PGN的培養(yǎng)基中2h。然后收集并處理HMC-1細胞以證明TLR2表達。數(shù)據(jù)顯示：TLR2在HMC-1細胞中的表達：0.28±0.06，在THP-1細胞中的表達：0.29±0.1，在HEK293中沒有表達。用抗TLR2抗體頇處理的細胞上述過程受到抑制。Western-Blot、免疫細胞化學的方法同樣證明TLR2參與

11、肥大細胞吸收PGN。
　　 4. RT-PCR結(jié)果顯示在MHC-1細胞中檢測到NOD2 mRNA（0.28±0.08），THP-1：0.27±0.06，而在HEK293細胞中沒有檢測到NOD2 mRNA。經(jīng)預處理的HMC-1細胞釋放組織胺與對照組相比明顯受到抑制。結(jié)果顯示，PGN被吸收入細胞后與NOD2捆綁在一起從而激活MHC-1。
　　 5.用免疫細胞化學的方法在共聚焦顯微鏡下觀察HMC-1，進一步檢測PGN是否被吸收

12、到MHC-1細胞內(nèi)。結(jié)果表明，PGN被HMC-1和THP-1細胞吸收，并且呈劑量依賴性，PGN沒有在HEK293細胞中檢測到。
　　 6. HMC-1和T84細胞單層共同培養(yǎng)于細胞跨膜培養(yǎng)系統(tǒng)中。分別在腸腔側(cè)中加PGN和不加PGN。在基底膜側(cè)中加MHC-1和不加MHC-1。HRP流量及TER作為記錄上皮屏障功能的指標。加入PGN組HRP的流量明顯增加，TER明顯降低，并呈劑量依賴性。用siRNA預處理TLR2和NOD2能抑制PG

13、N致T84細胞單層屏障的破壞。HRP回收率的增加及TEP的降低與HMC-1的
　　 數(shù)量呈平行關(guān)系。證實被激活的肥大細胞危及T84細胞單層的屏障功能。
　　 7. PGN溶于生理鹽水中以不同劑量給小鼠灌胃。腹瀉的嚴重程度與PGN呈劑量依賴性。結(jié)果表明PGN能夠誘導小鼠腹瀉。用PGN處理肥大細胞缺如小鼠（W/Wv）和肥大細胞正常同系小鼠（+/+），結(jié)果+/+小鼠出現(xiàn)腹瀉而W/Wv小鼠不出現(xiàn)腹瀉。結(jié)果表明，肥大細胞在PGN誘

14、導的腹瀉中起重要作用。
　　 8.用電子顯微鏡檢測肥大細胞脫顆粒，丟失顆粒成分或顆粒密度降低為脫顆粒表現(xiàn)。PGN處理的小鼠腸道組織肥大細胞脫顆?，F(xiàn)象非常明顯。PGN處理的小鼠肥大細胞脫顆粒的比率明顯增加，并呈劑量依賴性。用ELISA方法檢測PGN含量，與對照組相比PGN組，5-HT和組織胺水平明顯增高。用肥大細胞穩(wěn)定劑酮替酚處理和抗體對抗TLR2和NOD1明顯抑制5-HT和組織胺的釋放及肥大細胞脫顆粒。
　　 9.為了證

15、明PGN誘發(fā)肥大細胞激活的途徑，我們采用免疫印跡方法評估PGN對細胞質(zhì)IKB水平的影響。IKB水平的降低表明核因子IKB釋放及細胞核易位。用PGN處理P815細胞，Western Blot方法評估IKB-α，IKB-β磷酸化和非磷酸化表達，PGN能使IKB-α和IKB-β水平明顯降低，并且用抗-TLR2抗體和抗-NOD1抗體預處理能抑制上述過程。表明IKB-α和IKB-β參與來自于已易位于細胞核的細胞質(zhì)復合物的核因子IKB釋放。

16、　　 10.小鼠經(jīng)不同劑量肥大細胞穩(wěn)定劑酮替酚預處理，然后PGN灌胃，腹瀉被預處理的酮替酚抑制，并呈酮替芬劑量依賴性。PGN灌胃引起腹瀉發(fā)生后，腹腔注射酮替酚仍能阻止腹瀉的發(fā)生。抗組織胺和抗5-HT藥物協(xié)同作用能減弱PGN誘發(fā)的腹瀉。
　　 結(jié)論:
　　 1. PGN不直接改變?nèi)四c上皮細胞系T84細胞單層及小鼠腸上皮屏障功能；
　　 2. PGN激活HMC-1細胞造成T84細胞單層屏障功能減退；