肥大細(xì)胞在腦缺血中的變化及其對神經(jīng)元的作用.pdf

1、肥大細(xì)胞是由骨髓的多能造血干細(xì)胞分化而來.它們廣泛存在于包括人類在內(nèi)的哺乳動物的外周組織以及中樞神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi).腦內(nèi)的肥大細(xì)胞主要位于丘腦,分部于血管周圍,并與神經(jīng)纖維也有密切的接觸.肥大細(xì)胞胞體內(nèi)含有許多異染的顆粒,這些顆粒中貯藏了近二十種化學(xué)介質(zhì),包括:生物胺、細(xì)胞因子、神經(jīng)營養(yǎng)因子、脂質(zhì)代謝物、三磷酸核苷以及活性氧,它們參與了肥大細(xì)胞在腦內(nèi)的功能. 越來越多的研究發(fā)現(xiàn),肥大細(xì)胞與多種神經(jīng)系統(tǒng)疾病有關(guān),比如多發(fā)性硬化、阿爾采末病

2、和Wemicke's腦病. 在病理狀態(tài)下,腦內(nèi)肥大細(xì)胞的數(shù)量和脫顆粒程度都可能會發(fā)生變化.最近的研究表明,肥大細(xì)胞可能參與缺血引起的病理損傷.在心肌梗塞中,肥大細(xì)胞調(diào)節(jié)了梗塞后的炎癥反應(yīng)以及愈合期的心肌纖維的沉積和血管的形成.在骨骼肌缺血再灌注損傷中,肥大細(xì)胞通過其特異的蛋白酶加重了損傷.在腦內(nèi),已有研究發(fā)現(xiàn)肥大細(xì)胞出現(xiàn)在梗塞灶的周圍.肥大細(xì)胞可能通過多種方式影響周圍的腦組織.在外界條件的刺激下,肥大細(xì)胞發(fā)生脫顆?，F(xiàn)象,引起顆粒內(nèi)容物的

3、釋放.其中肥大細(xì)胞內(nèi)的組胺占丘腦內(nèi)組胺的90﹪,全腦組胺的50﹪.而組胺參與了缺血再灌注的早期的血腦屏障的破壞和腦水腫的形成,但是減輕了再灌注晚期的神經(jīng)元的損傷.肥大細(xì)胞也可以通過其介質(zhì)如活性氧等誘導(dǎo)白細(xì)胞的趨化從而引起炎癥反應(yīng).另外,肥大細(xì)胞與神經(jīng)元之間存在密切的接觸,肥大細(xì)胞內(nèi)的顆?？梢赞D(zhuǎn)入神經(jīng)元內(nèi),提示了肥大細(xì)胞可以影響神經(jīng)元的活性.所以肥大細(xì)胞可能在腦缺血損傷中起著重要的作用,并且可能影響了周圍的神經(jīng)元的活性.本課題著重研究腦缺

4、血損傷后肥大細(xì)胞的變化以及肥大細(xì)胞對神經(jīng)元作用. 本實驗采用大鼠四血管結(jié)扎(4VO)全腦缺血模型以及體外細(xì)胞缺氧缺糖(OGD)模型.肥大細(xì)胞甲苯胺藍(lán)染色后觀察細(xì)胞形態(tài)及計數(shù).組胺用高效液相測定;乳酸脫氫酶(LDH)利用試劑盒測定;細(xì)胞存活率利用MTT法測定. 本研究發(fā)現(xiàn)腦內(nèi)95-98﹪的肥大細(xì)胞位于丘腦,主要分布于血管周圍或者在神經(jīng)纖維叢中.腦缺血后,丘腦的肥大細(xì)胞數(shù)量下降,與對照組相比,在1、2、4小時時分別下降了56

5、、54、43﹪.然后又逐漸上升,缺血后1天時達(dá)到了對照水平.肥大細(xì)胞的數(shù)量在缺血后7天又下降,為對照組的64﹪.而肥大細(xì)胞脫顆粒的比例在缺血后7天出現(xiàn)顯著性增加,為對照組的2.13倍.對于缺血后肥大細(xì)胞在丘腦分布的研究發(fā)現(xiàn),丘腦中部(Bregma-2.80至-3.16 mm)的肥大細(xì)胞的變化趨勢與丘腦整個區(qū)域(Bregma-1.80至-4.20 mm)的變化相似.缺血后1小時,丘腦的肥大細(xì)胞出現(xiàn)普遍下降,但是丘腦中部的細(xì)胞沒有丘腦頭部和

6、尾部下降明顯.而且缺血1天后,丘腦中部的肥大細(xì)胞明顯增加,是對照組丘腦中部以及缺血組丘腦頭部和尾部(Bregrna-1.80至-2.80 mm和-3.16至.4.20mm)的2倍.丘腦和紋狀體的組胺含量在缺血后也出現(xiàn)明顯增加,但神經(jīng)元性組胺胞體所在的下丘腦沒有變化.本研究首次發(fā)現(xiàn)了腦內(nèi)肥大細(xì)胞在腦缺血后數(shù)量和脫顆粒狀態(tài)呈現(xiàn)了動態(tài)變化,提示了腦內(nèi)肥大細(xì)胞可能參與了腦缺血后的損傷過程. 在OGD誘導(dǎo)的體外缺血中,肥大細(xì)胞脫顆粒比例

7、在OGD 2小時后就出現(xiàn)明顯增加,16小時比對照組增加了71﹪.而組胺釋放率在OGD1小時后就出現(xiàn)了明顯上升,在16小時時比對照組增加了89﹪.LDH的釋放率也伴隨著脫顆粒比例和組胺釋放率增加,在2小時后有顯著性差異.研究表明缺血引起的缺氧缺糖本身即可引起肥大細(xì)胞的脫顆粒反應(yīng),并且這種脫顆粒反應(yīng)是細(xì)胞毒性反應(yīng). 因肥大細(xì)胞在缺血后呈動態(tài)變化,我們在體外進(jìn)一步研究肥大細(xì)胞對缺血引起的神經(jīng)元損傷的作用,并且利用具有神經(jīng)元特征的PC1

8、2細(xì)胞以減少原代培養(yǎng)中膠質(zhì)細(xì)胞混入所產(chǎn)生的復(fù)雜影響.研究發(fā)現(xiàn)肥大細(xì)胞OGD 1小時后提取的上清對PC12細(xì)胞在OGD引起的損傷中呈劑量依賴的保護(hù)作用.完全的100 μl的上清明顯逆轉(zhuǎn)了約70﹪的PC12細(xì)胞的損傷,50μl的上清逆轉(zhuǎn)了50﹪的細(xì)胞的損傷.同時肥大細(xì)胞的上清對PC12細(xì)胞OGD 1小時,恢復(fù)24小時后的損傷也有明顯緩解.另外肥大細(xì)胞上清對神經(jīng)元OGD 1小時后的損傷也有明顯的緩解作用,50μl的上清逆轉(zhuǎn)了約30﹪的損傷.而

9、上清的保護(hù)作用可被選擇性的H<,1>受體拮抗劑吡拉明濃度依賴的完全逆轉(zhuǎn),但H<,2>受體拮抗劑西米替丁對此沒有影響.組胺抗體也可以逆轉(zhuǎn)上清的保護(hù)作用.通過高效液相方法測得此上清中的組胺有效濃度為2至20 μM;而單獨給予組胺0.5至500μM并沒有保護(hù)作用.肥大細(xì)胞也可以釋放NGF,它被認(rèn)為是腦內(nèi)重要的神經(jīng)保護(hù)性因子.但是單獨給予NGF或與組胺協(xié)同給予都沒有明顯作用. 總之,本研究首次發(fā)現(xiàn),在全腦缺血損傷后丘腦的肥大細(xì)胞數(shù)量和

10、脫顆粒的比例出現(xiàn)了動態(tài)的變化,其中丘腦中部的肥大細(xì)胞在缺血后1天出現(xiàn)了明顯的聚集.另外丘腦和紋狀體的組胺水平增加,此增加可能來自于肥大細(xì)胞.在體外OGD損傷中發(fā)現(xiàn),肥大細(xì)胞的脫顆粒和組胺釋放明顯增加,同時伴隨著LDH釋放的增加,表明缺血引起的缺氧缺糖本身即可引起肥大細(xì)胞的脫顆粒反應(yīng),并且這種脫顆粒反應(yīng)是細(xì)胞毒性反應(yīng).另外,肥大細(xì)胞釋放的介質(zhì)對OGD引起的神經(jīng)元和PC12細(xì)胞的損傷有保護(hù)作用,這種保護(hù)作用是組胺依賴的,并且是組胺和除NGF