人偏肺病毒入胞機制的相關(guān)研究.pdf

1、人偏肺病毒（HMPV）是2001年首次由荷蘭學者從患者呼吸道分泌物中分離發(fā)現(xiàn)的，根據(jù)其病毒基因序列分析，HMPV屬于副粘病毒科肺病毒亞家族偏肺病毒屬。全球的流行病學調(diào)查顯示，HMPV在世界范圍內(nèi)呈現(xiàn)流行趨勢，易感人群為嬰幼兒、免疫功能受損的兒童及老年人，5歲以下的兒童100％感染過HMPV。與呼吸道合胞病毒（RSV）類似，HMPV可引起的臨床癥狀包括輕微的上呼吸感染、支氣管炎、肺炎、毛細支氣管炎等等。在兒童患者中，HMPV是僅次于RSV

2、的引起肺炎等嚴重下呼吸道感染的第二位病原體。近年來，HMPV引起嚴重的呼吸道感染， HMPV與其他病毒協(xié)同作用產(chǎn)生的嚴重后果，HMPV給移植后患者帶來的致死性感染等問題也越來越多的引起了研究人員的重視。在我們逐漸認識到HMPV給易感人群尤其是嬰幼兒帶來的嚴重危害時，實際上我們對這一種肺病毒家族的新成員了解的并不多。HMPV的感染機制，HMPV與宿主間的相互作用等并未研究清楚，目前也并無有效的疫苗可用于臨床預防。因此我們想通過研究病毒的入

3、胞機制了解HMPV與宿主細胞的相互關(guān)系，以期為后續(xù)的疫苗研究及防御措施等提供思路。進入宿主細胞是病毒感染發(fā)生的第一步。目前公認的病毒入胞方式主要有兩種：膜融合與胞吞。膜融合是病毒通過特異性受體與細胞表面結(jié)合，其病毒包膜與細胞膜發(fā)生融合，并將其遺傳物質(zhì)傳遞入細胞。胞吞是指病毒結(jié)合到宿主細胞后，病毒顆粒作為一個整體借助內(nèi)吞小體進入細胞的過程。對于有包膜病毒，膜融合是常見的入胞方式。但是隨著研究手段的多樣化，許多病毒都有新的入胞方式被發(fā)現(xiàn)。以

4、RSV為例，至今已發(fā)現(xiàn)RSV可通過膜融合、巨胞飲、網(wǎng)格蛋白介導的胞吞（CME）等途徑進入不同的宿主細胞。因此這也給了我們提示，對于HMPV的入胞方式我們能否有新的認知。本研究旨在探討HMPV的入胞機制，通過了解HMPV進入宿主細胞的方式，為未來HMPV的防治提供新的研究思路。本研究分為三個部分：
　　第一部分：人偏肺病毒的制備、純化及病毒基因拷貝數(shù)檢測方法的建立。
　　目的：建立穩(wěn)定的人偏肺病毒制備系統(tǒng)，培養(yǎng)并擴增HMPV病

5、毒，通過蔗糖純化獲得高濃度的HMPV病毒顆粒，為后續(xù)研究HMPV入胞實驗奠定基礎。建立HMPV病毒基因拷貝數(shù)檢測方法，為臨床及后續(xù)實驗檢測HMPV感染率提供簡易的分析方法。
　　方法：HMPV接種易感細胞Vero E6，于37℃，CO2孵箱中培養(yǎng)4-5天，每日觀察細胞病變CPE或GFP表達，待細胞病變或GFP陽性率達到峰值時，收取病毒上清。利用優(yōu)化的35%蔗糖梯度離心法純化病毒。采用TCID50方法測定病毒滴度。構(gòu)建HMPV F基

6、因質(zhì)粒標準品，采用Real-time PCR方法檢測HMPV病毒基因拷貝數(shù)。
　　結(jié)果：Vero E6細胞生長狀態(tài)良好，倍增速度快。接種HMPV00或者HMPV00-GFP后，培養(yǎng)至第4天或第5天，約80-90%的細胞可見CPE或GFP表達。經(jīng)蔗糖梯度離心純化后，HMPV00株病毒滴度可達到1.8×106 PFU/ml、HMPV00-GFP病毒滴度可達到1.1×107 PFU/ml。采用Taqman熒光探針法可特異性檢測低至3.3

7、×103 copies/ml的病毒核酸。
　　結(jié)論：成功建立了穩(wěn)定的人偏肺病毒增殖及純化系統(tǒng)。成功建立了低拷貝數(shù)HMPV病毒基因的檢測系統(tǒng)。
　　第二部分：兩種入胞機制-膜融合和胞吞方式在人偏肺病毒入胞過程中的確定及胞內(nèi)pH對人偏肺病毒感染率的影響。
　　目的：研究人偏肺病毒進入Vero E6及LLC-MK2兩種宿主細胞的過程中是否有膜融合及胞吞入胞方式的共同參與，并分別確定每種入胞方式所占的比例，對人偏肺病毒入胞機制

8、進行初步探討。同時研究胞內(nèi)低pH環(huán)境對人偏肺病毒感染率的影響，探討pH參與HMPV胞內(nèi)運輸?shù)淖饔谩?br>　　方法：采用間接免疫熒光的方法，檢測特異性抗HMPV融合蛋白抗體和特異性抗HMPV核蛋白抗體在感染宿主細胞內(nèi)的分布，研究HMPV入胞過程是否有胞吞方式的參與。利用脂溶性膜染料R18標記的HMPV病毒感染細胞，借助激光共聚焦顯微鏡和多功能酶標儀實時監(jiān)測R18熒光強度的變化，研究HMPV入侵宿主細胞的過程是否有膜融合的發(fā)生。同時選擇一

9、對熒光染料DiOC/R18共同標記病毒包膜，利用熒光共振能量轉(zhuǎn)移原理，在激光共聚焦顯微鏡下觀察DiOC/R18-HMPV感染過程中細胞內(nèi)融合事件的發(fā)生。利用pH指示劑Cy3/CypHer5共同標記病毒，使用共聚焦顯微鏡檢測標記后的病毒熒光變化，通過兩種熒光強度比例來檢測病毒在胞內(nèi)經(jīng)歷的pH變化。用胞內(nèi)酸化抑制劑氯化銨及巴甫洛霉素處理易感細胞后，接種HMPV00-GFP，培養(yǎng)24小時后檢測細胞中GFP陽性率，研究酸化抑制劑對HMPV感染率

10、的影響。
　　結(jié)果：利用間接免疫熒光方法發(fā)現(xiàn)，感染HMPV后，病毒融合蛋白（F）及病毒核蛋白（N）共同定位于Vero E6和LLC-MK2細胞中，這說明HMPV病毒顆粒是以完整的形式進入宿主細胞的。證明HMPV入胞的過程中存在胞吞的方式。在病毒感染2 h后，兩種細胞中FN蛋白共定位熒光分別占總N蛋白熒光的68.17%和83.88%。說明感染2 h后，約有2/3和4/5的HMPV病毒顆粒是被胞吞入胞的。R18融合實驗發(fā)現(xiàn)R18反淬滅

11、百分比DQ%約為30%，即約有1/3的HMPV通過膜融合的方式感染兩種宿主細胞。DiOC/R18共染實驗發(fā)現(xiàn)HMPV入胞過程中，融合事件不止是發(fā)生在易感細胞的表面，同時也發(fā)生在細胞內(nèi)部。說明HMPV感染Vero E6和LLC-MK2細胞時，既有膜融合的方式，也有胞吞方式的存在。在HMPV感染的2 h內(nèi)，胞內(nèi)低pH指示劑熒光染料CyPher5的熒光強度逐漸增加提示HMPV在宿主細胞內(nèi)經(jīng)歷了pH降低的過程。胞內(nèi)酸化抑制劑巴弗洛霉素和氯化銨處

12、理細胞后，HMPV感染率在Vero E6和LLC-MK2細胞中分別下降至48%、61%和59%、43%，說明了HMPV感染的發(fā)生需要依賴胞內(nèi)低pH。
　　結(jié)論：人偏肺病毒進入Vero E6和LLC-MK2兩種宿主細胞的過程中同時有膜融合和胞吞方式的參與，并且以胞吞方式為主。HMPV在LLC-MK2細胞內(nèi)轉(zhuǎn)運過程需要低pH的幫助，胞內(nèi)低pH有利于HMPV感染的發(fā)生。
　　第三部分：Clathrin及Caveolae介導的胞吞途

13、徑在人偏肺病毒感染宿主細胞中的作用。
　　目的：確定具體是哪一種胞吞途徑參與了人偏肺病毒的入胞過程，更加深入的研究其入胞機制相關(guān)分子，為防御病毒入侵、病毒疫苗研究提供科學的依據(jù)。
　　方法：利用一系列針對網(wǎng)格蛋白（clathrin）的化學阻斷劑如氯丙嗪、Pitstop，針對膜穴樣凹陷（caveolae）途徑的化學阻斷劑如甲基環(huán)糊精、菲律賓菌素，和胞吞途徑的非特異性阻斷劑如細胞松弛素D、金雀黃酮等，以及針對相關(guān)基因CLTC、C

14、AV等的小干擾RNA預處理易感細胞，然后再接種HMPV00-GFP。病毒感染24小時后，收集細胞，用流式細胞術(shù)檢測細胞GFP陽性表達率。分析比較各個阻斷劑處理組與未加藥物的對照組GFP陽性率的差異，研究各種阻斷劑對病毒感染率的影響，從而確定哪一種胞吞途徑對HMPV感染宿主細胞的貢獻最大。
　　結(jié)果：利用網(wǎng)格蛋白的阻斷劑CPZ、Pitstop，膜穴樣凹陷的阻斷劑MβCD作用Vero E6和LLC-MK2兩種細胞后，HMPV00-GF

15、P的感染率均有不同程度的下降。其中MβCD對HMPV感染率的影響最為顯著。使用MβCD處理后，Vero E6細胞中HMPV00-GFP陽性率分別降低至對照組的75.4%、30.8%、9.3%，而在LLC-MK2中MβCD使HMPV00-GFP陽性率下降為對照組的72.0%、29.7%、17.2%。此外filipin、cytochalasin D、genistein等對HMPV感染率均有一定的影響，使HMPV陽性率呈現(xiàn)輕到中度的降低。這幾