人偏肺病毒間接免疫熒光方法的建立及各種檢測方法的對比研究.pdf

1、第一部分 目的：人偏肺病毒（Human Metapneumovirus，hMPV）是2001年新發(fā)現(xiàn)的呼吸道病毒病原，主要導致嬰幼兒上下呼吸道感染。本研究擬建立檢測hMPV抗原的間接免疫熒光方法（immunofluorescence assay，IFA）。 方法：用hMPV感染非洲綠猴腎細胞株（Vero-E6），待出現(xiàn)明顯細胞病變（cytopathogenic effect，CPE）后刮下細胞，制備抗原片。建立以針對hM

2、PV融合蛋白（fusion protein，F(xiàn)）單克隆抗體為一抗的IFA方法并優(yōu)化，驗證hMPV IFA的特異性和靈敏度。選取重慶醫(yī)科大學兒童醫(yī)院因急性呼吸道感染新入院的患兒，無菌采集鼻咽分泌物。經(jīng)離心吹打處理標本，獲取細胞懸液制備抗原片。采用IFA方法進行臨床適用性評估。 結(jié)果：建立的IFA可特異性識別hMPV抗原，與其它常見呼吸道病毒病原抗原無交叉反應，其最低檢測下限為102.2 TCID50/ml，實驗重復性良好。采用該方

3、法檢測呼吸道感染患兒氣道標本523份，檢出hMPV陽性標本48份，陽性率為9.18％。 結(jié)論：成功建立了具有高特異性和重復性的hMPV IFA檢測方法，可用于hMPV感染氣道標本的快速診斷，為減少抗生素濫用，hMPV的流行病學和發(fā)病機制研究奠定了基礎。 第二部分 目的：對逆轉(zhuǎn)錄酶聯(lián)聚合反應（Reverse transcription polymerase chain reaction，RT-PCR）、實時熒光定量

4、酶聯(lián)聚合反應（Real-time reverse transcriptase PCR，Real-time PCR）、間接免疫熒光（IFA）三種hMPV檢測方法靈敏度進行對比研究。評估Real-time PCR及IFA的臨床使用價值，為臨床選擇適當?shù)臋z測方法提供理論依據(jù)。 方法：（1）將滴度為105.2TCID50/ml的hMPV按十倍梯度稀釋（101～107倍七個稀釋度），分別感染培養(yǎng)于六孔板中的Vero-E6細胞。病毒接種六天

5、后，105倍稀釋孔中細胞出現(xiàn)CPE。分別收集上清及細胞懸液，采用RT-PCR、Real-time PCR、IFA三種方法進行檢測，比較病毒分離及以上三種檢測方法靈敏度及重復性。（2）十倍梯度稀釋hMPV重組病毒，分別進行RT-PCR及Real-time PCR檢測，定量比較二者靈敏度。（3）Real-time PCR、IFA分別檢測523份重慶醫(yī)科大學附屬兒童醫(yī)院因急性呼吸道感染新入院患兒的鼻咽分泌物，分析其臨床適用性。 結(jié)果：

6、（1）IFA可檢測到104倍稀釋孔中病毒抗原，RT-PCR可檢測到105倍稀釋孔中病毒核酸，Real-time PCR可檢測到107倍稀釋孔中病毒核酸。（2）以病毒滴度為定量參考標準，RT-PCR和Real-time PCR檢測下限分別為103TCID50/ml、1TCID50/ml。（3）收集鼻咽分泌物標本609份，其中86份無足夠細胞進行IFA檢測。其余523，份標本中，IFA檢測到陽性標本48份。以500拷貝/微升為陽性標準時，R