人α防御素-5抗人乳頭瘤病毒作用及相關(guān)機(jī)制研究.pdf

1、防御素是人們?cè)谘芯坎溉閯?dòng)物、昆蟲等防御和抵抗病原微生物侵襲及感染過程中發(fā)現(xiàn)的一種內(nèi)源性陽離子多肽，因其具有廣譜抗菌作用以及不易產(chǎn)生耐藥的特點(diǎn)而被寄厚望成為新一代抗生素。近年來越來越多的研究表明，除了具有抗菌活性，防御素還具有顯著的抗病毒作用。此外，人們發(fā)現(xiàn)防御素作為天然免疫防線的重要成員，除可以直接殺傷、抑制病原微生物感染外，它還具有調(diào)節(jié)或激活免疫反應(yīng)的作用，使其間接的協(xié)助機(jī)體抵抗病原微生物感染。人α防御素-5(human defens

2、in-5，HD-5)主要由腸道Paneth細(xì)胞和女性生殖道粘膜上皮細(xì)胞表達(dá)和分泌，另外在尿道上皮組織中也檢測(cè)到HD-5的存在。正是由于這些區(qū)域經(jīng)常受到外來微生物的侵入，環(huán)境選擇導(dǎo)致的進(jìn)化壓力造就了HD-5具有突出的抗病原微生物活性，因此更具開發(fā)應(yīng)用價(jià)值。
　　 對(duì)于防御素的抗病毒作用，人們研究較多、較深入的是其抗包膜病毒如HIV、HSV等的作用，有關(guān)防御素對(duì)無包膜病毒的抗感染作用尚未引起人們的充分關(guān)注。人乳頭瘤病毒(human

3、papillomavirus，HPV)作為通過性傳播感染的常見的病原體，是一種典型的無包膜DNA病毒，約75%的人群在其一生中均會(huì)受到HPV感染；其主要侵害人生殖器、肛門以及口咽部位的上皮細(xì)胞。研究表明，高危型HPV的感染與一些肛門生殖器區(qū)腫瘤的發(fā)生之間有著一定關(guān)聯(lián)，其中HPV16、HPV18亞型的長(zhǎng)期感染已經(jīng)被證實(shí)為宮頸癌發(fā)生的一個(gè)主要誘因。而目市面上還前沒有針對(duì)HPV感染的特異性藥物，因此深入研究HD-5的抗HPV作用，有望為防治H

4、PV感染尋找新的治療途徑。
　　 由于HPV對(duì)宿主細(xì)胞有嚴(yán)格的特異性而且其增殖也依賴皮膚或黏膜細(xì)胞的分化，因此應(yīng)用常規(guī)的組織培養(yǎng)技術(shù)不易進(jìn)行大量制備；另外，從病變組織中分離獲取足夠數(shù)量的病毒用于抗病毒藥物的藥效評(píng)價(jià)也十分困難。隨著HPV假病毒制備技術(shù)的發(fā)展，現(xiàn)在已經(jīng)能夠通過質(zhì)粒轉(zhuǎn)染，較簡(jiǎn)單地使目的HPV病毒體在外培養(yǎng)的細(xì)胞內(nèi)進(jìn)行增殖、表達(dá)和組裝，并最終獲得足夠高滴度且包裹有熒光報(bào)告基因的HPV假病毒，從而便于病毒感染程度的直接觀

5、察和定量分析。
　　 另外，由于防御素分子內(nèi)存在著3對(duì)二硫鍵，采用化學(xué)合成法對(duì)其制備存在著很大的技術(shù)難度，從而在一定程度上限制了其開發(fā)與推廣應(yīng)用。至于二硫鍵對(duì)防御素活性的影響，人們的認(rèn)識(shí)并不一致，有些研究認(rèn)為二硫鍵可以顯著影響防御素的抗微生物活性；但也有研究認(rèn)為防御素的抗微生物活性主要與其所帶正電荷的多少有關(guān)，而與二硫鍵的存在與否關(guān)系不大。近來有文獻(xiàn)報(bào)道，二硫鍵的缺失不會(huì)顯著影響人β防御素3的抗菌活性，而去除了二硫鍵和半胱氨酸的

6、防御素或其衍生多肽則比較容易通過化學(xué)合成法進(jìn)行生產(chǎn)和制備。HD-5分子中的二硫鍵和半胱氨酸是否會(huì)影響其抗病毒活性，化學(xué)合成的HD-5線性多肽是否還具有抗病毒作用，這些都還缺乏深入研究。揭示二硫鍵及半胱氨酸在HD-5抗病毒活性中的作用，將會(huì)為其今后的研制與開發(fā)提供重要參考。
　　 本文利用HPV假病毒研究新技術(shù)首先制備了含綠色熒光蛋白(Green fluorescentprotein，GFP)報(bào)告基因的HPV16假病毒，并建立HP

7、V16假病毒感染宮頸癌細(xì)胞模型，然后采用熒光觀察和流式細(xì)胞分析技術(shù)測(cè)定了幾種不同構(gòu)型HD-5多肽的抗HPV16感染作用，同時(shí)還觀察了HD-5多肽的趨化作用。具體研究方法包括：通過將表達(dá)HPV16病毒衣殼蛋白的質(zhì)粒與GFP報(bào)告基因質(zhì)粒同時(shí)轉(zhuǎn)染293FT細(xì)胞，制備包含GFP報(bào)告基因的HPV16假病毒并用多種方式進(jìn)行鑒定，然后通過流式細(xì)胞分析測(cè)定GFP表達(dá)率來計(jì)算病毒滴度；用制備的HPV16假病毒感染3種不同宮頸癌細(xì)胞株，選定最合適的細(xì)胞感染

8、模型；合成HD-5/N(天然構(gòu)型)、HD-5/N-FAM(帶熒光標(biāo)記)、HD-5/Acm(半胱氨酸被Acm修飾，線性)、HD-5/Abu(半胱氨酸被Abu替換，線性)等HD-5多肽，首先采用激光共聚焦觀察HD-5/N-FAM與細(xì)胞的作用情況，然后采用鏡下熒光觀察和流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)在不同HD-5多肽作用48小時(shí)后，被HPV16假病毒感染的細(xì)胞中GFP蛋白的表達(dá)水平，并計(jì)算出多肽對(duì)病毒的抑制率；最后，分別用不同構(gòu)型HD-5多肽刺激Caski細(xì)

9、胞，ELISA法檢測(cè)細(xì)胞上清中趨化因子IL-8的分泌情況，以觀察HD-5多肽的間接趨化作用，同時(shí)，通過Transwell趨化遷移實(shí)驗(yàn)研究不同構(gòu)型HD-5多肽對(duì)中性粒細(xì)胞的直接趨化作用。
　　 本文取得了以下主要研究結(jié)果：
　　 (1)表達(dá)HPV16病毒衣殼蛋白的質(zhì)粒與GFP報(bào)告質(zhì)粒均成功轉(zhuǎn)染293FT細(xì)胞，經(jīng)鑒定最終制備出含GFP報(bào)告基因的HPV16假病毒，滴度達(dá)到2.3×108 TU/ml。
　　 (2)HPV

10、-16假病毒能夠感染體外培養(yǎng)的宮頸癌細(xì)胞，其中以C-33a細(xì)胞感染率最高。
　　 (3)HD-5/N能夠劑量依賴性地抑制HPV16假病毒感染C-33a細(xì)胞，在濃度為50μg/ml時(shí)，HD-5/N對(duì)HPV16假病毒感染的抑制率已接近100%。
　　 (4)HD-5/N-FAM與細(xì)胞作用2～3小時(shí)后，共聚焦顯微鏡觀察到HD-5可以大量進(jìn)入細(xì)胞質(zhì)，并且可能主要集中于內(nèi)吞體、溶酶體中。
　　 (5)濃度為20μg/ml的

11、HD-5/N、HD-5/Acm、HD-5/Abu對(duì)HPV16感染C-33a細(xì)胞的抑制率分別為96.48±5.67%、69.02±7.88%和2.71±1.530/0。與HD-5/N相比，HD-5/Acm的抗HPV作用顯著降低，而HD-5/Abu則基本失去抗HPV活性。
　　 (6)不同構(gòu)型HD-5刺激Caski細(xì)胞分泌趨化因子IL-8的能力由高到低依次為：HD-5/N>HD-5/Acm>HD-5/Abu；同樣，HD-5/N直接趨

12、化外周血中性粒細(xì)胞遷移的能力也顯著高于HD-5/Acm和HD-5/Abu。
　　 本文主要結(jié)論：
　　 (1)成功構(gòu)建了含GFP報(bào)告基因的HPV16假病毒感染宮頸癌細(xì)胞模型，建立了基于流式細(xì)胞分析的抗HPV病毒感染定量檢測(cè)方法，為準(zhǔn)確評(píng)價(jià)HD-5的抗HPV病毒感染作用奠定了基礎(chǔ)。
　　 (2)HD-5/N具有顯著抑制HPV-16病毒感染的作用，并證實(shí)HD-5可以進(jìn)入細(xì)胞質(zhì)中，提示HD-5可能通過限制病毒顆粒在細(xì)胞

13、內(nèi)的轉(zhuǎn)運(yùn)、脫衣殼等過程來發(fā)揮抗病毒作用。
　　 (3)與HD-5/N相比，HD-5/Acm的抗HPV16作用明顯減弱，提示二硫鍵對(duì)HD-5的抗病毒作用有著顯著影響；與HD-5/Acm相比，HD-5/Abu的抗HPV16作用進(jìn)一步減弱，提示HD-5多肽抗病毒作用的發(fā)揮依賴于分子中半胱氨酸殘基的存在。
　　 (4)HD-5/Acm、HD-5/Abu的間接和直接趨化作用均較天然結(jié)構(gòu)的HD-5明顯減弱，提示HD-5的趨化作用可能