人偏肺病毒部分基因克隆及蛋白表達(dá).pdf

1、[目的]
　　 1.建立hMPV的分子生物學(xué)篩查技術(shù)平臺(tái)。
　　 2.直接從臨床標(biāo)本中運(yùn)用長(zhǎng)片段RT-PCR方法構(gòu)建人偏肺病毒基因組亞克隆并進(jìn)行核酸序列測(cè)定，探討影響長(zhǎng)RT-PCR的因素，為全基因克隆打下基礎(chǔ)，以便進(jìn)一步了解其生物學(xué)特征。
　　 3.原核表達(dá)結(jié)合蛋白N及附加糖蛋白G，為臨床抗體檢測(cè)及預(yù)防提供基礎(chǔ)資料。
　　 4.初步了解深汕地區(qū)hMPV所致小兒呼吸道感染的特點(diǎn)，為快速診斷及治療提供依據(jù)。<

2、br>　　 [方法]
　　 1.標(biāo)本采集與處理
　　 收集我院及汕頭大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬兒童醫(yī)院2008年10月-2010年6月14歲以下呼吸道感染住院患兒咽拭子1137例，將采集的標(biāo)本置于3ml病毒保護(hù)液中，-80℃保存。
　　 2.引物設(shè)計(jì)
　　 通過(guò)查閱文獻(xiàn)，在GenBank中找到hMPV的全基因序列，利用Mega4.1Beta生物學(xué)分析軟件找到其保守區(qū)，根據(jù)保守區(qū)基因序列，使用Primer5.0和Ol

3、igo6.0軟件設(shè)計(jì)篩查、克隆引物并根據(jù)蛋白編碼序列位參考，在5’端引入酶切位點(diǎn)，設(shè)計(jì)核蛋白N及附加糖蛋白G擴(kuò)增引物。
　　 3.hMPV篩查
　　 根據(jù)本實(shí)驗(yàn)室已建立的呼吸道病毒RT-PCR擴(kuò)增體系及已確定為hMPV陽(yáng)性的標(biāo)本株作為陽(yáng)性對(duì)照進(jìn)行hMPV的篩查。
　　 4.hMPV的基因克隆
　　 運(yùn)用長(zhǎng)片段RT-PCR技術(shù)擴(kuò)增克隆基因片段，切割含目的條帶的凝膠進(jìn)行純化，并將目的片段連接到PJET1.2/

4、blunt克隆載體，轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞TOP10，經(jīng)含氨芐青霉素的抗生素平板篩選，得到陽(yáng)性克隆，提取質(zhì)粒，最后對(duì)重組質(zhì)粒進(jìn)行PCR鑒定和測(cè)序鑒定。
　　 5.hMPV的蛋白表達(dá)
　　 以hMPV陽(yáng)性標(biāo)本核酸為模板，擴(kuò)增G、N基因片段，經(jīng)限制性內(nèi)切酶BamHⅠ和EcoRⅠ消化后，連入表達(dá)載體PRSET-A，轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21，經(jīng)IPTG誘導(dǎo)，表達(dá)以his為標(biāo)簽的目的蛋白。
　　 [結(jié)果]
　　 1.建立了篩查

5、技術(shù)平臺(tái)。在1137份咽拭子標(biāo)本中，hMPV的檢出率為4.49％(51/1137)，男女比例為27:24，3歲及3歲以下患兒占陽(yáng)性檢出率的80.4％。51例hMPV陽(yáng)性病例中與其他病毒的混合感染率為56.86％(29/51)，其中混合感染率最高的是RSV和IVA，其次是RHV。陽(yáng)性患兒的臨床癥狀主要表現(xiàn)為發(fā)熱、咳嗽、喘息等呼吸道感染癥狀，少部分伴有胃腸道癥狀或抽搐。臨床診斷主要為支氣管肺炎(24例，其中三例合并高熱驚厥，1例合并診斷為全

6、身炎癥反應(yīng)綜合征)，喘息型肺炎(17例，1例合并腸炎)，毛細(xì)支氣管炎(9例，1例合并腸炎)，上呼吸道感染(1例)。
　　 2.本實(shí)驗(yàn)建立的長(zhǎng)片段RT-PCR方法，通過(guò)對(duì)各種影響因素的調(diào)整，包括退火溫度、緩沖液的濃度、酶、引物的濃度等，能較穩(wěn)定的擴(kuò)增出目的條帶。
　　 3.將本實(shí)驗(yàn)所得5株hMPV亞克隆基因片段與NCBI已經(jīng)公布的國(guó)內(nèi)外基因序列進(jìn)行核酸序列比較分析，發(fā)現(xiàn)DNA同源性大于85％，但相互之間變異則較大，尤其是克

7、隆片段2之間的變異最大，同源性小于30％。
　　 4.擴(kuò)增目的蛋白G、N基因片段，雙酶切后連入表達(dá)載體，轉(zhuǎn)化BL21，經(jīng)IPTG誘導(dǎo)，成功表達(dá)了以his為標(biāo)簽的目的蛋白。
　　 [結(jié)論]
　　 1.本研究共篩查了呼吸道標(biāo)本1137例，其中hMPV陽(yáng)性標(biāo)本51例，檢出率4.49％，感染患兒集中在3歲及以下，最常合并感染RSV和IVA，感染高峰主要是2、3、4、5月，這可能是hMPV在深汕地區(qū)的感染特點(diǎn)，也證實(shí)hMP