H1N1亞型流感病毒Vero細(xì)胞冷適應(yīng)株的選育及甲型流感病毒Vero細(xì)胞適應(yīng)株的ELISA檢測(cè).pdf

1、流感病毒減毒活疫苗采用滴鼻途徑免疫，能激發(fā)機(jī)體的細(xì)胞免疫、體液免疫和黏膜免疫，具有減免注射疼痛，免疫保護(hù)作用持久，有一定的交叉保護(hù)作用等優(yōu)點(diǎn)。目前上市的流感病毒減毒活疫苗是以雞胚為培養(yǎng)基質(zhì)生產(chǎn)的。然而，使用雞胚生產(chǎn)流感疫苗還存在著許多不足:遺傳性狀穩(wěn)定性差，降低了保護(hù)效果;交叉保護(hù)作用差;容易被其他致病因子所污染;純化工藝復(fù)雜;難以大規(guī)模生產(chǎn)等。Vero細(xì)胞是WHO推薦用于疫苗生產(chǎn)的細(xì)胞基質(zhì)，用其培養(yǎng)的流感病毒遺傳穩(wěn)定性好，質(zhì)量更高，還

2、可實(shí)現(xiàn)規(guī)?；a(chǎn)以滿足流感大流行的需要。
　　流感病毒Vero細(xì)胞冷適應(yīng)株是用流感病毒Vero細(xì)胞適應(yīng)株通過在低溫下連續(xù)傳代培養(yǎng)選育而出。本實(shí)驗(yàn)通過溫度梯度降溫法成功選育出了一株能在25℃生長的H1N1亞型流感病毒冷適應(yīng)株，血凝效價(jià)維持在1∶512以上。對(duì)該毒株在低溫培養(yǎng)時(shí)的PH值、TPCK胰酶的添加、BSA終濃度等條件進(jìn)行了優(yōu)化，并確定了病毒的適宜收獲時(shí)間。通過免疫熒光、血凝抑制試驗(yàn)以及感染性滴度測(cè)定對(duì)該毒株的生物學(xué)性狀進(jìn)行了鑒

3、定。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明該毒株與H1N1亞型Vero細(xì)胞適應(yīng)株為同一亞型。通過對(duì)該毒株在25℃、33℃、39℃的TCID50ml-1的比較，確定該毒株具有ts表型和ca表型。通過RT-PCR擴(kuò)增出該株流感病毒的8個(gè)基因片段，并將NA、NS、NP、M四個(gè)基因成功連接到雙向轉(zhuǎn)錄載體PHW2000上，并進(jìn)行基因測(cè)序分析。通過與對(duì)應(yīng)母本株基因的比對(duì)，確定了突變位點(diǎn)，為流感病毒冷適應(yīng)的相關(guān)基因研究奠定了基礎(chǔ)。
　　為了便于Vero細(xì)胞冷適應(yīng)株的選育