重組葡聚糖磷酸化酶催化淀粉制備葡萄糖-1-磷酸.pdf

1、葡萄糖-1-磷酸(G-1-P)有著重要的生理作用，它是糖原分解的第一個(gè)產(chǎn)物，可轉(zhuǎn)化為葡萄糖-6-磷酸，進(jìn)入EMP途徑;也可與UTP反應(yīng)生成UDP-葡萄糖，并進(jìn)一步合成各種糖苷鍵。應(yīng)用方面，G-1-P能阻止脂肪肝浸潤，促進(jìn)骨骼及牙齒中鈣的累積;其鉑螯合物更可用于癌癥的治療。G-1-P的生產(chǎn)主要是蔗糖磷酸化酶(SPase)催化蔗糖合成及葡聚糖磷酸化酶(GPase)催化可溶性淀粉合成。兩者各有優(yōu)缺點(diǎn)，就蔗糖而言，SPase是常溫酶，較難工業(yè)化

2、應(yīng)用，且蔗糖中一半的碳原子轉(zhuǎn)化為果糖，造成碳原子不完全利用。就可溶性淀粉而言，原料生產(chǎn)工藝繁瑣。且兩種底物價(jià)格均較高。理論上，GPase可以利用普通淀粉為原料，但是普通淀粉在常溫下不能糊化，很難利用。而高溫GPase催化淀粉原粉很好地解決了上述問題，成為合成G-1-P的理想方法。
　　本文工作以提高G-1-P產(chǎn)量及降低原料成本為出發(fā)點(diǎn)，將嗜熱菌Pyrococcusfuriosus中編碼GPase的基因在E.coli中重組表達(dá)，通過

3、條件及反應(yīng)過程優(yōu)化，利用重組GPase在高溫下催化普通淀粉產(chǎn)G-1-P。
　　將嗜熱古生菌Pyrococcus furiosus(DSM3638)中編碼葡聚糖磷酸化酶的基因根據(jù)已報(bào)道的序列(GenBank:1469411)對(duì)其中相對(duì)E.coli的稀有密碼子序列進(jìn)行優(yōu)化，將優(yōu)化后的基因序列進(jìn)行全合成。將全合成基因連接到pET-28a(+)質(zhì)粒上，構(gòu)建重組質(zhì)粒pET-28a-GP，轉(zhuǎn)化到E.coli BL21(DE3)中，構(gòu)建重組菌E

4、.coli BL21(DE3)/pET-28a-GP，誘導(dǎo)表達(dá)重組葡聚糖磷酸化酶，最優(yōu)誘導(dǎo)條件為:當(dāng)培養(yǎng)4h時(shí)，用0.2 mM IPTG誘導(dǎo)，誘導(dǎo)后28℃培養(yǎng)8h。利用重組GPase的耐熱性，對(duì)粗酶液高溫保溫處理，以此對(duì)GPase進(jìn)行純化。得到GPase純酶的比酶活為120.57U/mg，酶活回收率為85.31％。對(duì)催化條件進(jìn)行優(yōu)化，得最適催化條件為:80℃、pH6.6、5％淀粉/1 M磷酸鹽緩沖液。
　　考察GPase對(duì)不同淀粉

5、的催化能力，結(jié)果表明，在80℃條件下，其對(duì)普通淀粉的轉(zhuǎn)化率與可溶性淀粉相似(59％)。通過對(duì)反應(yīng)過程優(yōu)化，包括反應(yīng)液預(yù)處理、高濃度底物催化及補(bǔ)料催化，最終以7.5％玉米淀粉為底物，反應(yīng)16 h后補(bǔ)入2.5％玉米淀粉+0.2 M磷酸鹽緩沖液，繼續(xù)反應(yīng)32 h，最終G-1-P產(chǎn)量達(dá)259.87mM，轉(zhuǎn)化率達(dá)67.60％，高于與相同濃度的可溶性淀粉為底物的體系(252.9 mM，65.9％)。目前在GPase催化生產(chǎn)G-1-P的研究中，Jun

6、gdon等人以可溶性淀粉為底物，70℃條件下生產(chǎn)G-1-P，轉(zhuǎn)化率為68.78％，這是目前報(bào)道的最高值。而本實(shí)驗(yàn)以淀粉原粉為底物，80℃下制備G-1-P，轉(zhuǎn)化率達(dá)67.60％，與文獻(xiàn)報(bào)道相近，但是原料成本遠(yuǎn)低于文獻(xiàn)報(bào)道。
　　本文首次嘗試?yán)弥亟MGPase催化廉價(jià)易得的普通淀粉生產(chǎn)G-1-P，通過反應(yīng)過程優(yōu)化，提高G-1-P產(chǎn)量，與可溶性淀粉為底物相比，產(chǎn)量接近。表明淀粉可以替代可溶性淀粉為底物生產(chǎn)G-1-P，降低原料成本，同時(shí)建