酶膜反應器與離交法耦聯(lián)制備酪蛋白磷酸肽.pdf

1、應用酶膜反應器制備生物活性肽是近年來食品行業(yè)的重要研究領(lǐng)域，它集酶解、分離、純化和酶的回收利用于一體，可實現(xiàn)連續(xù)化操作，有利于降低生產(chǎn)成本，提高生產(chǎn)效率和經(jīng)濟效益。本文應用酶膜反應器(EMR)與離交色譜耦聯(lián)連續(xù)分離制備酪蛋白磷酸肽(CPP)。
　　 首先，研究建立酶膜反應器與離交色譜耦聯(lián)連續(xù)分離純化酪蛋白CPP工藝。選用堿性蛋白酶Alcalase(?)FG2.4L在切向流酶膜反應器中(膜截留分子量10kDa)連續(xù)酶解酪蛋白制備酪

2、蛋白生物活性肽，酶解溫度50℃，pH值8.5，時間3h，再采用樹脂層析將酪蛋白生物活性肽中的CPP與酪蛋白非磷酸肽(CNPP)分離。通過靜態(tài)吸附解析實驗確定了適合分離純化CPP的樹脂型號，并采用單因素實驗優(yōu)化了CPP動態(tài)分離工藝參數(shù)。確定了最佳分離樹脂型號為大孔弱堿性陰離子交換樹脂D303，在上樣流速1Bv/h、上樣量25mg/mL、洗脫溫度45℃、洗脫鹽酸濃度0.15M條件下，獲得磷酸肽的氮/磷摩爾比(N/P)為7.21，磷(P)洗脫

3、得率為93.11％。
　　 研究Alcalase、Trypsin、ProteaseN、Papain四種常用蛋白酶在酶膜耦聯(lián)工藝中對分離純化CPP的影響。四種蛋白酶分別在各自最佳的水解工藝條件下在超濾酶膜反應器中進行連續(xù)酶解反應。通過測定膜通量J、酪蛋白水解度DH、酶活力變化以及CPP的N/P摩爾比和得率等數(shù)據(jù)，分析確定最適的蛋白酶。研究結(jié)果表明：Alcalase在反應過程中殘余酶活力最高，酶泄漏最少，并且受熱力學作用、機械剪切作

4、用及膜吸附作用的影響小，酪蛋白的水解度及CPP得率較高，適合于本工藝生產(chǎn)制備CPP。
　　 本文在關(guān)注膜型號及超濾條件對CPP得率和N/P摩爾比的影響同時，重點研究了其對酶泄漏、膜通量降低及膜污染的影響。選用Alcalase分別在截留分子量為3kDa、5kDa、10kDa的切向流超濾酶膜反應器(EMR)中對酪蛋白進行連續(xù)水解。通過測定膜通量J、酪蛋白水解度DH、蛋白質(zhì)回收率Sapparent、酶活力變化及CPP得率、N/P摩爾比

5、等數(shù)據(jù)進行詳細分析，確定合適的膜型號及超濾條件。結(jié)果表明：低分子量超濾膜對酶的截留率達到90％以上，但膜通量較低，膜污染嚴重，產(chǎn)品得率低；高分子量超濾膜酶泄漏嚴重，但可以獲得低N/P摩爾比及高得率的CPP。研究還發(fā)現(xiàn)：增大超濾壓力會導致膜通量和蛋白質(zhì)回收率的大幅度提高，但會促使酶大量泄漏并對膜造成嚴重的污染。相反提高循環(huán)流量為140mL/min時，酶泄漏較少，膜污染程度相對降低，并可獲得較高的蛋白質(zhì)回收率。
　　 本研究實現(xiàn)了具