粉塵螨磷酸丙糖異構(gòu)酶克隆表達(dá)及過敏原性鑒定.pdf

1、目的:在原核表達(dá)系統(tǒng)中進(jìn)行表達(dá)純化重組磷酸丙糖異構(gòu)酶蛋白，并對該蛋白進(jìn)行過敏原性鑒定。
　　方法:
　?、偬崛》蹓m螨總RNA并逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，RT-PCR擴(kuò)增粉塵螨磷酸丙糖異構(gòu)酶基因；
　　②將上述PCR產(chǎn)物與pUC57連接后，熱轉(zhuǎn)化至E.coli Top10中，涂布于含氨芐霉素(100mg/L)的LB平板上，37℃培養(yǎng)過夜后從LB平板上挑選白色菌落放入LB培養(yǎng)液中擴(kuò)大培養(yǎng)，提取質(zhì)粒。用EcoR I和BamH I雙酶

2、切鑒定質(zhì)粒，公司測序正確后進(jìn)一步將酶切產(chǎn)物與pET-32a表達(dá)載體連接轉(zhuǎn)化至E.coli BL21；
　?、劾蒙飳W(xué)軟件進(jìn)行磷酸丙糖異構(gòu)酶生物信息學(xué)分析，根據(jù)軟件分析計(jì)算所得的數(shù)據(jù)構(gòu)造進(jìn)化樹；
　?、躀PTG誘導(dǎo)重組菌株表達(dá)；產(chǎn)物經(jīng)變性、復(fù)性、Ni-NTA螯合層析和Superdex75凝膠過濾層析純化；用Western blotting實(shí)驗(yàn)檢測重組磷酸丙糖異構(gòu)酶的免疫原性；
　?、菔占?份來自廣州醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院臨床皮

3、試的粉塵螨過敏患者陽性血清和2份健康體檢者血清樣本，用Western blotting、ELISA實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證重組蛋白的過敏原性。進(jìn)一步將重組磷酸丙糖異構(gòu)酶蛋白進(jìn)行人體皮膚點(diǎn)刺實(shí)驗(yàn)，檢測44例人體皮膚點(diǎn)刺中磷酸丙糖異構(gòu)酶蛋白的陽性率。
　　結(jié)果：
　　①結(jié)果成功構(gòu)建重組的克隆載體和表達(dá)載體，PCR結(jié)果表明在預(yù)期位置出現(xiàn)與預(yù)期大小相一致特異性條帶。
　?、谏飳W(xué)軟件分析磷酸丙糖異構(gòu)酶是氨基酸數(shù)為247，分子質(zhì)量為27134的

4、疏水性蛋白。
　?、跾DS-PAGE結(jié)果顯示，重組磷酸丙糖異構(gòu)酶蛋白以包涵體的形式在原核生物體系中大量表達(dá)，復(fù)性純化后的重組磷酸丙糖異構(gòu)酶純度較高，且重組蛋白能夠與抗His-tag單克隆抗體發(fā)生特異性結(jié)合。
　?、躓estern blotting、ELISA結(jié)果顯示，重組磷酸丙糖異構(gòu)酶與4例粉塵螨過敏患者血清呈強(qiáng)陽性反應(yīng)，2例健康對照組均為陰性。
　　⑤人體皮膚點(diǎn)刺實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，粉塵螨提取物人體皮膚點(diǎn)刺44例受試者中1