纖溶酶原激活劑及其相關(guān)分子在小鼠視神經(jīng)損傷與再生中的變化.pdf

1、眾所周知，在成年哺乳動(dòng)物，與周圍神經(jīng)系統(tǒng)相比，中樞神經(jīng)系統(tǒng)受損后再生和功能恢復(fù)比較困難。已有研究發(fā)現(xiàn)，雖然中樞神經(jīng)元軸突本身具有類似的再生潛能，但受損神經(jīng)元所處的微環(huán)境可能是決定其再生失敗的重要原因。
　　中樞神經(jīng)損傷后，在損傷區(qū)形成由變性髓鞘碎片、壞死細(xì)胞、沉積纖維蛋白和膠原纖維等成份組成的致密的膠質(zhì)瘢痕，使大多數(shù)發(fā)芽的軸突不能越過此膠質(zhì)瘢痕而停止生長。為了促進(jìn)新生軸突能夠穿越這些膠質(zhì)瘢痕到達(dá)失神經(jīng)支配的靶器官，大量的蛋白酶參與

2、了此過程。
　　纖溶酶原激活劑(Plasminogen activators，PAs)是一種絲氨酸蛋白酶，在體內(nèi)主要是通過激活纖溶酶原(Plasminogen，Plg)轉(zhuǎn)變?yōu)槔w溶酶(plasmin，Pln)，后者是一種廣譜的蛋白水解酶，能夠降解細(xì)胞外的細(xì)胞受體、生長因子及細(xì)胞外基質(zhì)組分。金屬基質(zhì)蛋白酶(Matrix metalloproteinases，MMPs)是一組鋅依賴的蛋白水解酶，由正常組織細(xì)胞和炎癥及腫瘤細(xì)胞產(chǎn)生，以無活

3、性的酶原形式分泌，參與細(xì)胞外基質(zhì)(extracellular matrix，ECM)的降解及ECM不同組成成分的重塑，參與神經(jīng)系統(tǒng)的病變調(diào)控和組織修復(fù)過程。
　　本課題以屬于中樞神經(jīng)的小鼠視神經(jīng)為研究對(duì)象，通過建立成年小鼠視神經(jīng)夾傷模型，用形態(tài)學(xué)和生物學(xué)方法研究小鼠視神經(jīng)損傷后及其再生過程中，神經(jīng)夾傷部位破損血管中溢出的血源性因子，主要包括：免疫球蛋白(immunoglobulinG，Ig G)、纖維蛋白(原)(fibrin(og

4、en))、纖溶酶原激活物(plasminogenactivators，PAs)及金屬基質(zhì)蛋白酶-9(matrix metalloproteinase-9，MMP-9)的表達(dá)變化情況，以了解ECM各蛋白酶在視神經(jīng)損傷后的變化，分析ECM蛋白酶活性的變化與小鼠視神經(jīng)損傷及再生之間的關(guān)系，為更深一步揭示炎癥性損傷的中樞神經(jīng)的再生修復(fù)微環(huán)境所起作用奠定基礎(chǔ)。
　　材料與方法：
　　健康成年雄性C57 BL/6J小鼠，腹腔注射麻醉后，

5、行外眥切開術(shù)，暴露視神經(jīng)，在距視神經(jīng)球后起始部約2mm處，用顯微鉗鉗夾視神經(jīng)45s；縫合皮膚切口。左眼作為自身對(duì)照，僅暴露視神經(jīng)，不作鉗夾處理。
　　模型鼠構(gòu)建完成后，于術(shù)后1h、2h、4h、8h、16h、1d、2d、7d和28d分別進(jìn)行心臟灌注沖洗血液，取材做組織切片及提取視神經(jīng)蛋白，采取HE染色測(cè)定在小鼠視神經(jīng)夾傷后視神經(jīng)的變性，用Western blot方法檢測(cè)損傷后不同時(shí)間點(diǎn)視神經(jīng)組織內(nèi)神經(jīng)絲(Neurofilament，

6、NF)、MMP-9、fibrin(ogen)、IgG的表達(dá)量變化情況，同時(shí)采用原位酶譜分析法檢測(cè)plasminogen activators(PAs)活性在視神經(jīng)損傷后各階段的變化。
　　結(jié)果：
　　HE染色結(jié)果顯示，隨著小鼠視神經(jīng)夾傷后的時(shí)間延長，視神經(jīng)潰變逐漸加重，視神經(jīng)纖維走行迂曲、排列不規(guī)則，膠質(zhì)細(xì)胞核增多、排列紊亂，可見細(xì)胞呈空泡樣變性。
　　Western blot方法結(jié)果顯示，正常視神經(jīng)組織內(nèi)NF蛋白表達(dá)

7、水平較高，在損傷早期，視神經(jīng)組織中NF維持較高的水平(接近于對(duì)照)，直至損傷后第7d，NF的表達(dá)呈現(xiàn)出明顯的下降，至損傷后28天視神經(jīng)組織內(nèi)僅能檢測(cè)到少量NF。在正常視神經(jīng)組織內(nèi)，只有微量的IgG表達(dá)，而損傷側(cè)的視神經(jīng)組織內(nèi)IgG表達(dá)水平明顯增加，損傷后28d仍能檢測(cè)出大量的表達(dá)；只有微量的纖維蛋白沉積在對(duì)照側(cè)正常神經(jīng)組織內(nèi)，而損傷側(cè)神經(jīng)組織在損傷后1小時(shí)就能檢測(cè)出纖維蛋白的溢出，至損傷后第7d纖維蛋白沉積基本被清除。在對(duì)照側(cè)神經(jīng)組織內(nèi)

8、，只有微量的MMP9表達(dá)，損傷后的視神經(jīng)MMP-9的蛋白水平有少許增加，在損傷后2d達(dá)到高峰，以后仍有高水平的表達(dá)，但MMP-9是以活性較低的前體形式存在的，分子量92 KDa。
　　原位酶譜法結(jié)果顯示，視神經(jīng)損傷后1d視神經(jīng)周圍即可見邊界清晰的黑色溶解帶，至損傷后第7d溶解帶范圍最大，而反應(yīng)體系中給予特異性的尿激酶型纖溶酶原激活劑(Urokinase Plasminogen Activator，uPA)酶活性抑制劑阿米洛利將uP

9、h酶活性抑制后，發(fā)現(xiàn)黑色溶解帶幾乎消失。表明PA活性在視神經(jīng)損傷后即出現(xiàn)增高，在損傷后第7天達(dá)到高峰，一直持續(xù)到第28天時(shí)仍有很高的活性，且起作用的PA主要是uPA。
　　結(jié)論：
　　小鼠視神經(jīng)夾傷動(dòng)物模型的成功建立，為研究微環(huán)境在中樞神經(jīng)損傷及再生中的作用提供了有用的工具。沉積于損傷部位的fibrin(ogen)清除情況與IgG不同，不依賴于BNB的徹底修復(fù)，表明CNS的損傷，能夠引發(fā)較為迅速強(qiáng)烈的PA/Plg/Pln級(jí)聯(lián)