抑制肝內(nèi)膽管癌細胞增殖的表觀遺傳學藥物篩選及HC toxin對CCLP-1細胞的作用機制研究.pdf

1、目的:
　　肝內(nèi)膽管癌(Intrahepatic Cholangiocarcinoma，ICC)是原發(fā)于肝臟的惡性腫瘤，來源于次級膽管遠端微小膽管的上皮細胞，其惡性程度很高、預后差;雖然發(fā)病率不高，約占原發(fā)性肝癌的10％～20％，占所有膽管癌的10％，但近幾十年來呈上升趨勢，尤其是西方國家。目前，手術(shù)仍是主要的治療方法，但是由于其臨床癥狀不明顯，早期診斷很困難，限制了根治性手術(shù)的開展，對于不能手術(shù)的ICC患者，肝臟移植在遠期效果上

2、還存在很大的爭議?；煼矫妫懙滥[瘤化療方案多以采用順鉑+吉西他濱療效較好，但對于ICC還沒有大型的臨床研究數(shù)據(jù)支持。由于ICC微環(huán)境豐富、異質(zhì)性差別大，而且具有很強的促結(jié)蹄組織增殖能力，這使得其對一般的化療容易產(chǎn)生耐受性。因此尋找敏感的化療藥物，解決化療耐受性問題，對于治療ICC具有十分重要的意義。
　　表觀遺傳學機制主要包含脫氧核糖核酸（DNA）的甲基化、非編碼核糖核酸(RNA)調(diào)節(jié)、組蛋白修飾、基因與蛋白的磷酸化過程以及溴蛋

3、白結(jié)構(gòu)域修飾等，它們在環(huán)境因素影響的疾病中起著很重要的作用，在ICC的病理生理過程中，多種表觀遺傳學機制也發(fā)揮了重要的作用。目前，針對表觀遺傳學機制開發(fā)的藥物被認為在治療癌癥、心腦血管慢性疾病和精神神經(jīng)等疾病中具有巨大潛力，并且有很多藥物已經(jīng)進入各期臨床研究。而應用于ICC治療的基礎及應用研究還屬于相對空白的區(qū)域。因此從表觀遺傳學位點調(diào)控出發(fā)，開發(fā)的表觀遺傳學藥物在治療ICC方面可能具有很好的前景，而組蛋白去乙?；?Histonede

4、acetylase,HDAC)抑制劑HC toxin(Helminthosporium carbonum toxin, HCtoxin)可能成為其中的一種。
　　近年來發(fā)現(xiàn)Notch信號通路的激活可使成熟的肝細胞轉(zhuǎn)變成ICC前體細胞，這使得Notch信號通路在ICC的發(fā)病機制上的研究受到極大的關(guān)注，同時，Notch通路也受到了表觀遺傳學方面的調(diào)控，尤其是HDAC修飾對該通路的影響存在不小的爭議，這提示我們在開發(fā)HDAC相關(guān)類藥物用

5、以治療ICC時必須考慮其對Notch通路可能的影響。
　　基于以上研究背景，本課題分為三組實驗，主要目的有三:
　　實驗一:針對ICC細胞株，進行表觀遺傳學藥物的篩選，得出對ICC細胞較為敏感的藥物，為ICC的新藥物化療提供前期實驗基礎。
　　實驗二:探討HDAC抑制劑HC Toxin對ICC細胞的在增殖、細胞周期、凋亡等多方面生物學功能上的影響。
　　實驗三:探討HDAC抑制劑HC Toxin對ICC細胞Not

6、ch信號通路的影響。
　　方法:
　　針對三組實驗，分別采用以下方法完成
　　實驗一:
　　1.針對ICC細胞株RBE，采用CCK-8細胞活力檢測法，對Cayman公司提供的表觀遺傳學藥物文庫No.11076，進行單一時間點的藥物初步篩選。
　　2.用CCK-8細胞活力檢測，將上訴初步篩選所得出的敏感藥物以及吉西他濱(Gemcitabine)對HuCCT1、CCLP-1、TFK-1、RBE等多種ICC細胞進

7、行處理，在多濃度梯度上作抑制效果的比較，并確定其半數(shù)有效抑制率。
　　實驗二:
　　1.用細胞計數(shù)法及平板細胞克隆形成實驗，檢測HC Toxin對ICC細胞系CCLP-1增殖及克隆形成能力的影響。
　　2.用光學顯微鏡下觀察吉姆薩染色前后HC Toxin對ICC細胞CCLP-1的形態(tài)學影響，探索該過程中可能的生物學過程。
　　3.用7-AAD染色的流式細胞技術(shù)，檢測ICC細胞CCLP-1經(jīng)HC toxin處理一定

8、時間后的細胞周期的分布，探索HC toxin對ICC細胞周期的影響。
　　4.用AnnexinⅤ FITC和7-AAD聯(lián)合染色的流式細胞技術(shù)，檢測ICC細胞CCLP-1經(jīng)HC toxin處理一定時間后細胞的凋亡情況，探索HC toxin對細胞凋亡的影響。
　　實驗三:
　　1.用反轉(zhuǎn)錄實時熒光定量PCR(RT-qPCR)檢測ICC細胞CCLP-1經(jīng)HC toxin處理一定時間后Notch1等部分重要基因轉(zhuǎn)錄情況變化。<

9、br>　　2.用細胞免疫熒光試驗(Immunofluorescence，IF)及蛋白免疫印跡法(Western Blot)，檢測ICC細胞CCLP-1經(jīng)HC toxin處理一定時間后Notch通路相關(guān)蛋白notch1、Hes1等的表達變化。
　　3.用CCK-8細胞活力檢測法，檢測Notch通路抑制劑DAPT單獨或聯(lián)合HCtoxin對CCLP-1的細胞活力的影響。
　　結(jié)果:
　　實驗一:
　　1.所選表觀遺傳學

10、文庫共有95種表觀遺傳學藥物，其中27 uM的高濃度藥物作用下，有22種表觀遺傳學藥物對RBE細胞有抑制作用，包括HDAC抑制劑12種(HCToxin, TSA, SAHA,4-iodo-SAHA, SB939, CAY10398, M344, ITF2257，Oxamflatin，Scriptai，CBHA，CAY10603);組蛋白甲基化轉(zhuǎn)移酶抑制劑3種(Chaetocin，GSK343，BIX01294);組蛋白去甲基化轉(zhuǎn)移酶抑制

11、劑2種(PFI-1，GSK-J4);磷酸化抑制劑2種（Bromosporine，JQ1）;溴蛋白結(jié)構(gòu)域抑制劑1種（phthalazinone pyrazole）;DNA甲基化酶抑制劑1種(Neplanocin A);而在3uM藥物濃度下對RBE細胞仍具有強烈抑制作用的有HC Toxin，TSA，SAHA，4-iodo-SAHA及Chaetocin，其中前4種均為HDAC抑制劑。
　　2.對HC Toxin，TSA，SAHA和吉西他

12、濱(Gemcitabine，GEM)進行多種細胞株、多濃度梯度的藥效比較，發(fā)現(xiàn)HC toxin的抑制作用均較TSA、SAHA、TSA、GEM等強烈，其次是TSA、而GEM最弱。其中，HC toxin對CCLP-1，HuCCT1，TFK-1，RBE的半數(shù)有效抑制率，分別為297.6+80.4 nM，520.0+43.0 nM，854.6+86.9 nM,713.7+27.3 nM。
　　實驗二:
　　1.細胞計數(shù)表明:HC t

13、oxin能抑制CCLP-1細胞增殖，并呈現(xiàn)一定的濃度與時間依賴性。平板克隆形成實驗表明:經(jīng)不同濃度HC toxin處理后，細胞克隆形成能力減弱，在HC toxin濃度大于100 nM時與藥物濃度呈正相關(guān)，50 nM以內(nèi)差異無統(tǒng)計學意義。
　　2.用光學顯微鏡觀察吉姆薩染色前后的CCLP-1形態(tài)變化顯示，經(jīng)HC toxin處理48小時后出現(xiàn):①細胞密度變小，細胞體積縮小，細胞質(zhì)成分減少，分裂像減少;②部分細胞變圓脫落，帶凋亡小體的細

14、胞明顯增多，而細胞脹大破裂者少見;③樹突狀結(jié)構(gòu)。計算出現(xiàn)凋亡小體的細胞數(shù)量，發(fā)現(xiàn)HC toxin引起細胞出現(xiàn)凋亡小體與HC toxin濃度呈正相關(guān)關(guān)系。
　　3.7-AAD染色的流式細胞技術(shù)實驗顯示，與對照組相比實驗組經(jīng)HC toxin處理48小時后，G0/G1期細胞比例明顯上升，G2/M期細胞比例明顯下降，呈現(xiàn)濃度依賴性，而S期細胞比例變化不具統(tǒng)計學意義。
　　4.AnnexinⅤ FITC聯(lián)合7-AAD染色的流式細胞技術(shù)

15、實驗顯示，與對照組相比，實驗組經(jīng)HC toxin處理48小時后早期凋亡、晚期凋亡及總凋亡的細胞比例均明顯增多，呈現(xiàn)濃度依賴性，差異具有統(tǒng)計學意義。
　　5.Western blot實驗表明，經(jīng)HC toxin處理48小時后，CCLP-1細胞中某些凋亡相關(guān)蛋白cytochrome c、bax/bcl-2的相對表達量在各個濃度組的差異無統(tǒng)計學意義，caspase3在HC toxin濃度為400 nM時較對照組有增加，而其他實驗組與對照

16、組差異無統(tǒng)計學意義。
　　實驗三:
　　1.RT-qPCR檢測表明經(jīng)HC-Toxin處理一段時間后，CCLP-1中Notch1等6個基因轉(zhuǎn)錄水平發(fā)生了一定的改變。STAT3等10個基因轉(zhuǎn)錄水平變化沒有統(tǒng)計學意義。
　　2.Immunofluorescence實驗和Western blot實驗表明，HC toxin處理CCLP-1細胞后，Notch通路被激活，Notch通路相關(guān)蛋白Notch1、Hes1表達量明顯增加，并

17、呈現(xiàn)濃度相關(guān)性。
　　3.CCK-8細胞活力檢測試驗顯示，Notch通道阻滯劑DAPT濃度低于50uM時對CCLP-1細胞無明顯的抑制作用，但可以明顯增強200 nM HC toxin對CCLP-1細胞活力的抑制作用，當DAPT大于50uM時對CCLP-1細胞具有明顯的抑制作用，并與HC toxin呈現(xiàn)協(xié)同作用.
　　結(jié)論:
　　1.多種表觀遺傳學藥物在體外能對ICC細胞RBE具有強烈的抑制作用，其中HDAC抑制劑尤為

18、突出，提示HDAC有可能是抑制RBE細胞增殖的敏感靶位，但證據(jù)還不夠充分。
　　2.HC toxin對多種ICC細胞具有強烈的抑制作用，效果比其他HDAC抑制劑和吉西他濱強烈，并呈現(xiàn)一定的濃度與時間依賴性。其對ICC細胞的作用是綜合的，多方面的，與抑制細胞增殖，阻滯細胞周期，促進細胞凋亡有一定關(guān)系。
　　3.HC toxin對CCLP-1細胞活力既有抑制作用也有促進作用，抑制作用大于促進作用，促進作用可能與HC toxin激