膽管癌表遺傳學(xué)研究——去甲基化修飾對(duì)RASSF1A基因的表達(dá)調(diào)控及對(duì)人膽管癌細(xì)胞的生物學(xué)效應(yīng).pdf

1、表遺傳學(xué)是指基于非基因序列改變所導(dǎo)致的基因表達(dá)水平變化，它決定了基因轉(zhuǎn)錄的開(kāi)關(guān)及其表達(dá)方式。當(dāng)人類(lèi)進(jìn)入后基因組時(shí)代后，尤其是人類(lèi)表觀基因組計(jì)劃的提出和實(shí)施，表遺傳學(xué)引起了越來(lái)越多的學(xué)者關(guān)注，并逐漸成為闡明基因組功能的關(guān)鍵研究領(lǐng)域之一。DNA甲基化是表遺傳學(xué)的主要內(nèi)容之一，也是基因表達(dá)重要的調(diào)控方式之一，它可通過(guò)基因啟動(dòng)子及其附近區(qū)域內(nèi)CpG島胞嘧啶的甲基化關(guān)閉某種組織或細(xì)胞不必需的基因，使之不表達(dá)或沉寂。DNMTs是催化和維持DNA甲基

2、化的關(guān)鍵酶，在DNA甲基化中起著十分重要的作用。 腫瘤形成是一個(gè)多因素、多基因和多途徑的病理過(guò)程，其發(fā)生與癌基因的激活和抑癌基因的失活有關(guān)。許多研究表明，抑癌基因的失活與啟動(dòng)子區(qū)域高甲基化有密切關(guān)系，而DNMTs的表達(dá)水平升高和活性增加被認(rèn)為是引起抑癌基因啟動(dòng)子區(qū)域發(fā)生高甲基化的主要原因之一。 在鄒聲泉教授的領(lǐng)導(dǎo)下，我們課題組在前期研究中應(yīng)用DNMTs抑制劑5-Aza-CdR對(duì)人膽管癌細(xì)胞的生長(zhǎng)周期進(jìn)行觀察，發(fā)現(xiàn)5-Az

3、a-CdR可以在體內(nèi)外抑制膽管癌細(xì)胞的增殖，促進(jìn)細(xì)胞凋亡，說(shuō)明DNMTs在膽管癌的發(fā)生發(fā)展中扮演著重要的角色，也提示我們通過(guò)干預(yù)DNMTs的表達(dá)從而調(diào)控腫瘤相關(guān)基因的甲基化狀態(tài)和治療膽管癌具有潛在的意義。同時(shí)還發(fā)現(xiàn)，抑癌基因RASSF1A在肝外膽管癌組織中的轉(zhuǎn)錄表達(dá)缺失高達(dá)68.75％，明顯高于其在癌旁組織中的表達(dá)缺失率，并與肝外膽管癌的淋巴轉(zhuǎn)移及TNM分期相關(guān)；通過(guò)甲基化特異性PCR和DNA測(cè)序證實(shí)了啟動(dòng)子區(qū)域CpG島高甲基化是RAS

4、SF1A基因表達(dá)缺失的主要機(jī)制之一。 為了進(jìn)一步探討DNA甲基化與基因表達(dá)和腫瘤形成之間的關(guān)系，我們以催化DNA甲基化發(fā)生的兩個(gè)甲基轉(zhuǎn)移酶—DNMT1、DNMT3b和抑癌基因RASSF1A為研究靶標(biāo)，通過(guò)反義RNA技術(shù)下調(diào)DNMT1和DNMT3b在人膽管癌細(xì)胞中的表達(dá)，初步研究DNMT1和DNMT3b在調(diào)控RASSF1A啟動(dòng)子區(qū)域甲基化狀態(tài)及其表達(dá)的機(jī)制，同時(shí)觀察下調(diào)DNMT1和DNMT3b的表達(dá)對(duì)人膽管癌細(xì)胞生長(zhǎng)的生物學(xué)效應(yīng)，

5、為膽管癌的表遺傳學(xué)發(fā)生機(jī)制和基因治療提供新的理論基礎(chǔ)和實(shí)驗(yàn)依據(jù)。 第一部分：DNMT1、DNMT3b基因在人膽管癌中的表達(dá)及意義 論文1：DNMT1和DNMT3b基因在人膽管癌組織和細(xì)胞中的表達(dá)及意義 目的研究DNA甲基轉(zhuǎn)移酶1(DNMT1)和DNA甲基轉(zhuǎn)移酶3b(DNMT3b)在人膽管癌組織和人膽管癌細(xì)胞系QBC939中的表達(dá)情況，并分析DNMT1和DNMT3b的表達(dá)率與膽管癌臨床病理因素之間的關(guān)系，探討二者在

6、膽管癌發(fā)生發(fā)展過(guò)程中的作用。 結(jié)論 1.在膽管癌組織中，DNMT1和DNMT3b蛋白的表達(dá)較膽管炎組織明顯增加，并與腫瘤組織分化程度有關(guān)，與性別、年齡、腫瘤大小、腫瘤部位、有無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和臨床分期無(wú)明顯關(guān)系，說(shuō)明DNMT1和DNMT3b的高表達(dá)可能與膽管癌的發(fā)生發(fā)展有關(guān)，且可能是膽管癌發(fā)生中的一個(gè)早期分子事件。 2.DNMT1和DNMT3b在人膽管癌細(xì)胞系QBC939中存在表達(dá)。 第二部分：反義DNMT1

7、和反義DNMT3b基因真核表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建及鑒定 論文2：反義DNMT1基因真核表達(dá)質(zhì)粒的鑒定 目的鑒定所獲反義DNMT1基因真核表達(dá)質(zhì)粒的正確性，為研究DNMT1基因功能提供工具和依據(jù)。 論文3：反義DNMT3b基因真核表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建及鑒定 目的構(gòu)建反義DNMT3b基因真核表達(dá)質(zhì)粒，為研究DNMT1基因功能提供工具。 結(jié)論通過(guò)基因克隆技術(shù)，成功構(gòu)建了反義DNMT3b基因真核表達(dá)質(zhì)粒，為進(jìn)一步研究D

8、NMT3b基因功能提供了實(shí)驗(yàn)工具。 第三部分：反義DNMT1和反義DNMT3b基因轉(zhuǎn)染對(duì)人膽管癌細(xì)胞中RASSF1A基因的表達(dá)調(diào)控及其生物學(xué)效應(yīng) 論文4：DNMT1、DNMT3b基因共下調(diào)誘導(dǎo)人膽管癌細(xì)胞中RASSF1A基因啟動(dòng)子區(qū)域去甲基化及其重新表達(dá) 目的觀察聯(lián)合轉(zhuǎn)染反義DNMT1、DNMT3b基因真核表達(dá)質(zhì)粒對(duì)人膽管癌細(xì)胞系QBC939中RASSF1A基因啟動(dòng)子區(qū)域甲基化和該基因表達(dá)的影響，初步探討DNMT

9、1、DNMT3b基因在DNA甲基化和基因表達(dá)調(diào)控中的作用。 結(jié)論 1.轉(zhuǎn)染反義DNMT1、DNMT3b基因真核表達(dá)質(zhì)粒能使人膽管癌細(xì)胞系QBC939中DNMT1、DNMT3b蛋白表達(dá)水平降低 2.同時(shí)下調(diào)DNMT1和DNMT3b在QBC939細(xì)胞中的表達(dá)或單獨(dú)下調(diào)DNMT1的表達(dá)，能使RASSF1A基因啟動(dòng)子區(qū)域去甲基化和誘導(dǎo)其重新表達(dá)，其中以前者效果顯著。單獨(dú)下調(diào)DNMT3b的表達(dá)對(duì)RASSF1A基因啟動(dòng)子區(qū)域

10、甲基化狀態(tài)及其表達(dá)沒(méi)有影響。 3.在DNA甲基化和相關(guān)基因的表達(dá)調(diào)控中，DNMT1起著主要作用，DNMT3b扮演著協(xié)同角色，但二者存在效應(yīng)依賴(lài)關(guān)系，將其聯(lián)合作用可發(fā)揮1+1＞2的增效效應(yīng)。 論文5：DNMT1、DNMT3b基因共下調(diào)對(duì)人膽管癌細(xì)胞的生物學(xué)效應(yīng) 目的觀察聯(lián)合轉(zhuǎn)染反義DNMT1、DNMT3b基因真核表達(dá)質(zhì)粒對(duì)人膽管癌細(xì)胞系QBC939體內(nèi)外生長(zhǎng)和增殖能力的影響，初步探討DNMT1、DNMT3b基因在膽

11、管癌發(fā)生中的作用。 結(jié)論 1.通過(guò)聯(lián)合轉(zhuǎn)染反義DNMT1和DNMT3b基因真核表達(dá)質(zhì)粒，可同時(shí)下調(diào)DNMT1和DNMT3b在QBC939細(xì)胞中的表達(dá)，并能在體內(nèi)外抑制QBC939細(xì)胞生長(zhǎng)，促進(jìn)凋亡發(fā)生，其效果明顯優(yōu)于單獨(dú)轉(zhuǎn)染反義DNMT1基因。 2.在DNA甲基化的過(guò)程中，DNMT1起著主要作用，DNMT3b扮演著協(xié)同角色，二者存在效應(yīng)依賴(lài)關(guān)系，將其聯(lián)合作用可發(fā)揮1+1＞2的增效效應(yīng)，并可能通過(guò)甲基化途徑與膽管癌