aPKC-ι調控膽管癌細胞EMT及化療抵抗作用中的機制研究.pdf

1、第一部分、aPKC-ι和E-Cadherin在膽管癌組織中的表達及與預后的相關性研究
　　目的：檢測aPKC-ι和E-Cadherin在膽管癌組織中的表達，并探討兩者的表達與膽管癌患者臨床預后的關系。
　　方法：選取自2008年1月到2013年6月期間華中科技大學同濟醫(yī)學院附屬同濟醫(yī)院膽胰外科64例經(jīng)手術切除及經(jīng)病理證實的膽管癌組織及10例膽總管囊腫病人膽管組織標本為研究對象。采用免疫組化（IHC）、實時定量聚合酶鏈反應（q

2、RT-PCR）、免疫印跡法（Western blot）方法檢測上述組織標本中aPKC-ι、E-Cadherin基因和蛋白的差異表達情況。采用卡方檢驗和t檢驗檢測aPKC-ι和E-Cadherin的表達與臨床病理分化和TNM分期的關系，采用Cox多因素回歸分析膽管癌患者預后獨立影響因素。
　　結果：aPKC-ι在51.56％的膽管癌組織中呈高表達（33/64），在76.56%的癌旁組織中呈低表達（49/64），而正常組織中低表達則占

3、100%（10/10）。aPKC-ι在膽管癌組織中的表達明顯高于癌旁組織（χ2=10.8,P=0.001）、正常組織（χ2=9.306,P=0.002）。E-cadherin在67.2%的膽管癌組織中呈低表達（43/64），在32.8%的癌旁組織（21/64）和90%的正常組織（9/10）中呈高表達。E-cadherin在膽管癌組織中的表達明顯低于癌旁組織（χ2=16.949,P<0.001）、正常組織（χ2=10.614,P<0.00

4、1）。aPKC-ι的表達水平與膽管癌分化程度呈負相關（χ2=9.002，P=0.003），與膽管癌TNM分期密切相關，呈正相關（χ2=7.000,P=0.008）。E-cadherin的表達水平與膽管癌分化程度呈正相關（χ2=6.585，P＜0.001），與膽管癌TNM分期呈負相關（χ2=5.505,P＜0.001）。Cox多因素回歸分析顯示，腫瘤分化程度、TNM分期、aPKC-ι及E-cadherin表達水平是影響膽管癌患者預后的獨立

5、因素。
　　結論：aPKC-ι和E-Cadherin的表達水平與膽管癌的分化程度、TNM分期及預后密切相關，并且是膽管癌患者的獨立預后因素。
　　第二部分、aPKC-ι通過Snai1調節(jié)膽管癌細胞EMT
　　目的：研究aPKC-ι調控膽管癌細胞EMT過程中的分子機制。
　　方法：體外傳代培養(yǎng)膽管癌細胞系TFK-1至對數(shù)期。合成攜帶aPKC-ι低表達(aPKC-ι-siRNA)、aPKC-ι過表達(aPKC-ι-s

6、aRNA)的慢病毒包裝質粒，并構建穩(wěn)定aPKC-ι低表達TFK-1細胞（aPKC-ι-siRNA-TFK-1）、aPKC-ι過表達TFK-1細胞（aPKC-ι-saRNA-TFK-1）。實驗設置空白對照組（Blank）及陰性對照組（Control），并采用qRT-PCR、Western Blot檢測不同實驗組aPKC-ι、E-cadherin、Vimentin、Snai1、Snai2表達情況。為進一步檢測aPKC-ι調節(jié)EMT過程中的關

7、鍵作用靶點，選取aPKC-ι過表達組TFK-1（aPKC-ι-saRNA-TFK-1）細胞，運用Si-RNA技術靶向下調Snai1表達，設置空白對照組（Blank），采用qRT-PCR、Western Blot檢測不同實驗組aPKC-ι、E-cadherin、Vimentin、Snai1表達情況。
　　結果：和Blank、Control組比較，伴隨著aPKC-ι的表達下調，aPKC-ι-siRNA-TFK-1細胞中的E-cadhe

8、rin表達量明顯增高，Vimentin表達量則顯著降低，Snai1的表達量出現(xiàn)下降；而aPKC-ι過表達的aPKC-ι-saRNA-TFK-1細胞中上述標志物的表達情況則正好相反。各個實驗組中Snai2的表達量則無明顯變化。aPKC-ι-saRNA-TFK-1細胞轉染Si-Snai1后，和對照組相比，實驗組aPKC-ι表達無差異，伴隨著Snai1的表達量下降，其E-cadherin表達量出現(xiàn)升高，Vimentin表達量則出現(xiàn)下降。

9、>　　結論：aPKC-ι是調節(jié)膽管癌EMT過程中的關鍵分子，并且該調節(jié)作用是依賴于轉錄因子Snai1的介導作用來完成的。
　　第三部分、aPKC-ι調節(jié)膽管癌細胞化療抵抗作用中的機制研究
　　目的：研究aPKC-ι調控膽管癌細胞化療抵抗作用中的機制。
　　方法：體外傳代培養(yǎng)膽管癌細胞系 TFK-1至對數(shù)期。選取 Blank、aPKC-ι-siRNA-TFK-1、aPKC-ι-saRNA-TFK-1細胞為實驗對象，分別使

10、用不同濃度吉西他濱（0.1μg/ml、1μg/ml、5μg/ml、10μg/ml）、順鉑（1μg/ml、10μg/ml、20μg/ml、50μg/ml）作用于上述細胞，采用CCK-8方法檢測不同實驗組細胞在藥物作用12h、24h、48h、72h的細胞生存率，并計算不同實驗組細胞的IC50值。采用流式細胞學方法檢測不同實驗組細胞在不同藥物最佳濃度作用后細胞的凋亡情況。最后采用Western blot檢測上述實驗中藥物抵抗蛋白P-gp、凋亡

11、蛋白Caspase3的表達情況。
　　結果：CCK-8檢測結果顯示，吉西他濱、順鉑對細胞的增殖抑制作用具有濃度及時間依賴性，隨著藥物作用濃度的增加和作用時間的延長，三種細胞的生存率均出現(xiàn)不同程度的下降。其中，aPKC-ι-siRNA-TFK-1細胞的下降程度最為明顯。Blank、aPKC-ι-siRNA-TFK-1、aPKC-ι-saRNA-TFK-1細胞對吉西他濱的IC50值分別為1.52μg/ml、0.56μg/ml、2.78

12、μg/ml（P＜0.001），對順鉑的IC50值則分別為9.3μg/ml、5.7μg/ml、16.3μg/ml（P＜0.001）。流式細胞學檢測結果表明，藥物對aPKC-ι-siRNA-TFK-1細胞的誘導凋亡作用最為明顯，而aPKC-ι-saRNA-TFK-1細胞則未見明顯凋亡。Western blot結果顯示，aPKC-ι-siRNA-TFK-1細胞中藥物抵抗蛋白P-gp的表達量較對照組明顯下降，藥物作用后凋亡蛋白 Caspase3