四妙勇安湯對缺氧人臍靜脈內(nèi)皮細胞的影響

1、<p>　　四妙勇安湯對缺氧人臍靜脈內(nèi)皮細胞的影響</p><p>　　作者：劉真,魏運湘,于慧卿,馬秀娟,王強,李武衛(wèi),李永新</p><p>　　【摘要】 目的 觀察四妙勇安湯對體外培養(yǎng)的人臍靜脈內(nèi)皮細胞(HUVEC)缺氧損傷模型的影響。方法 實驗分為3組,即正常組、模型組、四妙勇安湯組,后2組建立體外細胞缺氧模型,用四甲基偶氮唑藍(MTT)實驗觀察四妙勇安湯對缺氧內(nèi)皮細胞

2、存活率的影響,測定四妙勇安湯對缺氧內(nèi)皮細胞乳酸脫氫酶(LDH)漏出量的影響,并用免疫熒光法檢測細胞中血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)生成量的表達。結(jié)果 四妙勇安湯能顯著增加MTT實驗中各孔吸光度值,降低LDH漏出量,增加VEGF的生成量。結(jié)論 四妙勇安湯具有保護缺氧的HUVEC損傷的作用,其作用機制與增加細胞活性、降低缺氧造成的細胞毒性、增加VEGF的表達、促進血管新生的作用有關(guān)。 </p><p>　　【關(guān)鍵詞】

3、 四妙勇安湯;缺氧;人臍靜脈內(nèi)皮細胞;血管新生</p><p>　　Abstract：Objective To study the effect of Simiaoyongantang on human umbilical vein endothelial cells (HUVECs) injury induced by hypoxia. Methods The HUVECs were divided into

4、normal group, model group and Simiaoyongantang group, and the hypoxia model was established at the latter two groups. The livability of HUVECs was measured by MTT assay. The transudation of LDH in the medium was measured

5、 by biochemistry and the positive expression of VEGF was detected by immunofuorescence chemistry. Results </p><p>　　Key words：Simiaoyongantang;hypoxia;human umbilical vein endothelial cells;angiogenesis</

6、p><p>　　自從Hockel等[1]提出了“治療性血管生成”的概念后,以促血管生長因子誘導(dǎo)心腦血管組織新生血管形成,已成為治療性血管新生研究中最為活躍的領(lǐng)域。組織缺血缺氧后首先受到影響的是內(nèi)皮細胞,因此,對內(nèi)皮細胞的研究成為了研究缺血缺氧性疾病的重要手段。人臍靜脈為體外獲得內(nèi)皮細胞的重要來源,故選用人臍靜脈內(nèi)皮細胞(HUVEC)作為實驗對象?，F(xiàn)代藥理研究表明,四妙勇安湯能夠擴張血管,疏通及促進血液循環(huán),使未閉塞的

7、動脈及側(cè)枝循環(huán)變粗、增多,已經(jīng)廣泛應(yīng)用于治療血栓閉塞性脈管炎。近年來研究表明,此方對心血管疾患療效確切[2]。本實驗從細胞活性、乳酸脫氫酶(LDH)漏出量、血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)生成量3個方面觀察了四妙勇安湯對缺氧HUVEC的影響。</p><p><b>　　1 實驗材料</b></p><p><b>　　1.1 試劑</b></

8、p><p>　　1640干粉(Gibco公司),明膠(Sigma公司),胎牛血清(杭州四季青公司),100 U/mL青霉素、80 ?g/mL鏈霉素(華北制藥),胰蛋白酶(Amersco公司),四乙酸乙二胺-二鈉(disodium edetate,EDTA),Earle液(河北醫(yī)科大學(xué)),兔抗人Ⅷ因子相關(guān)抗原(bs-0332R,北京博奧森生物公司),VEGF(北京博奧森生物公司),異硫氫酸熒光素(fluorescein

9、 isothiocyanate,FITC)標記山羊抗兔多克隆IgG(ZF-0311,北京中杉金橋),HUVEC (KG110,南京凱基生物公司),四甲基偶氮唑藍(MTT,Amersco公司),二甲亞砜(DMSO,Gibco公司),磷酸鹽緩沖液(PBS,華瑞創(chuàng)新生物公司),LDH試劑盒(上海豐匯科技公司)。</p><p><b>　　1.2 主要儀器</b></p><p

10、>　　CO2培養(yǎng)箱(Thermo),倒置相差顯微鏡(Olympus),熒光顯微鏡(Olympus),微量振蕩器(FU HUA ZW-A),酶標儀(TECAN SUNRISE),全自動生化儀(東芝120)。</p><p><b>　　2 實驗方法</b></p><p>　　2.1 四妙勇安湯的制備</p><p>　　按原方準確稱取每味

11、中藥(金銀花90 g,玄參90 g,當(dāng)歸30 g,甘草15 g),加入15倍的三蒸水(即1 g藥加15 mL去離子水)急火煎煮1.5 h,16層紗布過濾,濾出藥渣,隔水濃縮至原藥材濃度為3 g/mL的藥液,此時(60 ℃)藥液相對密度為1.18 g/mL。冷卻后用60%乙醇5～6 ℃沉淀24 h,傾去上清,水浴濃縮成稠膏。4 ℃保存?zhèn)溆谩Ｓ脮r用培養(yǎng)液稀釋成原藥材濃度為64 ?g/mL的使用液。</p><p>　

12、　2.2 內(nèi)皮細胞缺血缺氧模型的建立</p><p>　　參考文獻[3]方法,HUVEC細胞株經(jīng)Ⅷ因子相關(guān)抗原免疫熒光鑒定為內(nèi)皮細胞。將傳代培養(yǎng)3～4代HUVEC細胞接種于6孔培養(yǎng)板中,孔底預(yù)先鋪有明膠包被過的蓋玻片,待融合成完整細胞單層后棄去原培養(yǎng)液,用無菌PBS緩沖液洗2次,加入Earle液3 mL,輕輕地將無菌石蠟油600 ?L滴入Earle液,使其完整覆蓋于Earle液表面,將6孔培養(yǎng)板置于37 ℃、5%

13、 CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h。同時設(shè)未加石蠟油的標本為正常組。</p><p><b>　　2.3 分組及處理</b></p><p>　　四妙勇安湯組：缺氧HUVEC中加入10%四妙勇安湯的1640細胞培養(yǎng)液,放入37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h。模型組：缺氧HUVEC中加入正常1640培養(yǎng)液,放入37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h。正常組：正常細

14、胞加入正常1640培養(yǎng)液,放入37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h。每組均設(shè)置6個復(fù)孔。</p><p><b>　　2.4 MTT實驗</b></p><p>　　細胞接種于96孔板中,參照上述缺氧模型及實驗分組分別建立96孔板中缺氧模型及進行實驗分組。每組均設(shè)8個復(fù)孔。將MTT配成終濃度為0.5 mg/mL的使用液。棄去96孔板中原培養(yǎng)液,各孔加入MTT使用液

15、100 ?L,37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中孵育1 h。取出培養(yǎng)板倒置,棄去原MTT,加入DMSO 100 ?L,微量振蕩器振蕩15 min。用酶標儀在測定波長492 nm、參考波長620 nm處測定各孔吸光度值[4]。</p><p>　　2.5 乳酸脫氫酶漏出量的檢測</p><p>　　每組設(shè)6個復(fù)孔。按試劑盒說明,收集各組細胞培養(yǎng)液2 mL, 1 000 r/min離心3 min,提

16、取上清液50 ?L,加入試劑盒自帶試劑3 000 ?L,混勻后置37 ℃,分別于30、60 s時讀取吸光度值。使用前用蒸餾水在340 nm處調(diào)零。</p><p>　　2.6 免疫熒光法測定血管內(nèi)皮生長因子生成量</p><p>　　取出6孔板各孔中蓋玻片,PBS輕輕沖洗3次,每次持續(xù)約1 min,10%福爾馬林固定液室溫固定10 min,PBS輕輕沖洗3次,每次持續(xù)約1 min,10%馬

17、血清70 ?L室溫封閉非特異性抗體20 min,加入一抗VEGF(兔抗人,1∶100稀釋)70 ?L,37 ℃孵育1 h,同時以PBS代替一抗作為對照組。PBS輕輕沖洗3次,每次持續(xù)約1 min,加入FITC標記的二抗(羊抗兔IgG,1∶25稀釋)70 ?L,37 ℃孵育30 min。立即置于熒光顯微鏡下觀察,綠色熒光顆粒為陽性表達,于1×400目鏡下取10個視野計數(shù)。</p><p><b>

18、;　　3 統(tǒng)計學(xué)方法</b></p><p>　　實驗數(shù)據(jù)用—(—數(shù))±s表示,數(shù)據(jù)均用統(tǒng)計學(xué)軟件SAS6.12版進行統(tǒng)計學(xué)分析,多組間比較采用方差分析。</p><p><b>　　4 結(jié)果</b></p><p>　　(見表1～表3)　表1 四妙勇安湯醇沉藥液對缺氧HUVEC活性的影響(—(—的)±s)注：與

19、模型組比較△P&lt;0.01;與正常組比較,*P&lt;0.01(下同)表2 四妙勇安湯醇沉藥液對缺氧HUVEC細胞毒性的影響(—(—毒)±s)表3 四妙勇安湯醇沉藥液對缺氧HUVEC中VEGF生成量的影響(—(—量)±s)</p><p><b>　　5 討論</b></p><p>　　缺氧可明顯損害內(nèi)皮細胞功能,缺氧細胞模型

20、的建立有利于排除在體實驗中眾多的干擾因素,可以更加準確地了解缺氧后內(nèi)皮細胞的功能變化及調(diào)控機制,較以往在體實驗更加真實準確。采用HUVEC,較動物內(nèi)皮細胞更符合人體生理特點,有利于進行人體缺氧后內(nèi)皮細胞內(nèi)生物活性物質(zhì)變化與相應(yīng)組織器官缺氧后病理改變關(guān)系和其作用機制的研究[3]。</p><p>　　四妙勇安湯首見于清·鮑相敖《驗方新編》,為治療脫疽的古方?，F(xiàn)代臨床常用于治療熱毒型血栓閉塞性脈管炎,或其他

21、原因引起的血管栓塞病變。所有這些病變的基本病理基礎(chǔ)為血栓閉塞引起局部組織血液供應(yīng)發(fā)生障礙,產(chǎn)生急性或慢性的嚴重而持續(xù)的缺血缺氧甚至纖維化、壞死。四妙勇安湯具有清熱解毒、活血止痛的功效,多年來,我們根據(jù)“異病同治”的治療原則,將四妙勇安湯用于治療缺血性心臟血管病變,取得較為滿意的臨床療效。本實驗采用中藥醇沉方法,減少了異體血清由于不同種屬對實驗結(jié)果的影響。</p><p>　　MTT在一定的濃度下可被細胞攝取,并被

22、線粒體脫氫酶氧化為藍紫色甲臜顆粒,各孔顆粒產(chǎn)生量與活細胞數(shù)成正比,因此可用此實驗檢測細胞存活率[4]。模型組與正常組相比,細胞存活率明顯降低。與模型組相比,加入四妙勇安湯醇沉藥液后,細胞存活率明顯升高,可以推測,四妙勇安湯可以通過減輕缺氧造成的細胞毒性,增加細胞存活率,有一定的抗缺氧作用。</p><p>　　缺氧時細胞膜通透性增加,無氧代謝增強,細胞內(nèi)LDH升高并釋放到細胞培養(yǎng)液中。模型組與正常組相比,LDH漏

23、出量明顯升高。與模型組相比,加入四妙勇安湯醇沉藥液后,LDH漏出量明顯降低,可以推測,四妙勇安湯可以明顯減輕缺氧對內(nèi)皮細胞的損傷,促進細胞有氧代謝,抑制無氧酵解及乳酸堆積來維持細胞膜的功能,有一定的膜保護作用,從而達到對內(nèi)皮細胞的保護作用[5]。</p><p>　　VEGF是一種內(nèi)皮細胞特異性有絲分裂原和活體血管新生誘導(dǎo)者,是調(diào)節(jié)血管新生的最重要的細胞因子之一,是有高度特異性的血管內(nèi)皮細胞生長刺激因子,能特異性

24、地作用于血管內(nèi)皮細胞,刺激其增殖,促進側(cè)支血管的形成,參與血管的新生[6]。因此,VEGF因其對內(nèi)皮細胞作用的特異性而廣泛應(yīng)用于實驗性肢體及心肌缺血的研究。本實驗中,模型組與正常組相比,VEGF陽性表達數(shù)量明顯較少。與模型組相比,加入四妙勇安湯醇沉藥液后,VEGF陽性表達數(shù)量明顯增多,因此可以推斷,四妙勇安湯可以通過影響內(nèi)皮細胞的內(nèi)分泌功能,增加VEGF的生成,達到促血管新生的作用。</p><p>　　綜上所述

25、,四妙勇安湯能明顯增加缺氧損傷的HUVEC存活率,降低其LDH漏出量,增加VEGF的生成,促進血管新生。其他作用機制還有待于進一步研究。</p><p><b>　　【參考文獻】</b></p><p>　　[1] Hockel. Angio tropintreatment prevents flap necrosis and enhances dermal rege

26、neration in rabbits[J]. Arch Surg,1989, 124(6)：693-698.</p><p>　　[2] 王 筠,袁 卓,張軍平.四妙勇安湯對人臍靜脈內(nèi)皮細胞ECV304的增殖作用[J].中華中醫(yī)藥學(xué)刊,2007,25(9)：1818-1820.</p><p>　　[3] 艾 荀,顧玉東.培養(yǎng)人臍靜脈內(nèi)皮細胞慢性缺血缺氧模型[J].中華手外科雜志,200

27、1,17(4)：233-236.</p><p>　　[4] 張卓然.培養(yǎng)細胞學(xué)與細胞培養(yǎng)技術(shù)[M].上海：上?？茖W(xué)技術(shù)出版社, 2004.90-92,425-426.</p><p>　　[5] 吉瑞瑞,李付英,張雪靜,等.淫羊藿對缺氧誘導(dǎo)血管內(nèi)皮細胞損傷的保護作用[J].中國中西醫(yī)結(jié)合雜志,2005,25(6)：525-530.</p><p>　　[6] 沈