人臍靜脈內(nèi)皮細胞缺氧早期基因表達譜研究.pdf

1、一、方法 1．制作臍靜脈內(nèi)皮細胞株(EA.hy926)缺氧模型，檢測常氧和缺氧1 h、3 h、6 h、12 h各時相點ICAM-1、HIF-1α蛋白表達情況。 2．將細胞分為常氧組和缺氧3 h組，分別提取總RNA，依照Invitrogen公司LongSAGE kit說明，構(gòu)建常氧和缺氧3 h臍靜脈內(nèi)皮細胞Long SAGE文庫，具體操作簡述如下：制備mRNA，合成cDNA雙鏈，錨定酶酶切后的cDNA片段等分兩份，分別與A

2、、B接頭連接；然后以標簽酶酶切，并連接形成雙標簽；PCR擴增，分離純化雙標簽；雙標簽隨機連接形成串聯(lián)子并將其克隆至pZero載體中，測序。測序結(jié)果經(jīng)軟件分析，獲得標簽序列及豐度信息，通過與Genbank數(shù)據(jù)庫比對確認基因。 3．生物信息學分析：通過NCBI ftp://ftpl.nci.nih.gov/pub/SAGE/HUMAN/Hs long.best gene.gz平臺分析去除多重匹配標簽中的冗余標簽，統(tǒng)計差異表達P值<0

3、.05的有意義標簽，納入后續(xù)分析(信號途徑活化分析除外)；根據(jù)單一匹配有意義標簽在2個LongSAGE文庫中差異表達，總結(jié)缺氧后表達明顯上調(diào)和下調(diào)的基因；通過制作MA散點圖了解缺氧和常氧兩個SAGE文庫中標簽的分布情況；制作常氧和缺氧臍靜脈內(nèi)皮細胞基因表達圖譜；采用在線數(shù)據(jù)庫(http://www.discover.nci.nih.gov/gominer/)，基于GO (Gene Ontology，有譯為“基因本體”或者“基因注釋”)生

4、物信息學系統(tǒng)，對SAGE文庫中P值小于0.05的差異表達基因進行了基因功能注釋和分類；基因富集分析采用PERL程序(geneid2path.pl)，通過KEGG(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes)平臺預測分析缺氧早期血管內(nèi)皮細胞信號通路與生化途徑改變。 4．常氧和缺氧臍靜脈內(nèi)皮細胞基因表達譜的驗證：RNA水平的驗證采用熒光定量PCR，對SAGE文庫中隨機挑選的5個已知基因進行驗證，比

5、較缺氧后其在RNA水平變化是否與SAGE文庫中所得結(jié)果相符。采用結(jié)合標簽的基因序列延伸(GLGI)技術(shù)對從文庫中選取的3個無匹配標簽進行擴增，確定其是否屬于未知新基因。與常氧和缺氧基因表達譜相關(guān)蛋白質(zhì)驗證采用Western blot檢測缺氧后VEGF、PCNA蛋白表達變化。與常氧和缺氧基因表達譜相關(guān)細胞功能驗證采用細胞計數(shù)繪制缺氧前后細胞生長曲線、流式細胞儀分析缺氧后細胞周期改變、以及Annexin V方法檢測短暫缺氧后細胞凋亡發(fā)生率，

6、對缺氧早期促細胞增殖和凋亡效應等方法進行驗證。 5．Western blot檢測缺氧后血管內(nèi)皮細胞Integrin β1蛋白表達變化；轉(zhuǎn)染Integrinβ1全長啟動子熒光素酶報告基因至細胞，轉(zhuǎn)染48 h后行缺氧3 h處理，檢測缺氧前和缺氧后不同時間Integrin β1啟動子活性變化；構(gòu)建Integrin β1熒光小RNA干擾載體，轉(zhuǎn)染EA.hy926細胞，篩選穩(wěn)定低表達細胞株，通過繪制常氧、缺氧狀態(tài)下正常EA.hy926細胞

7、和下調(diào)表達細胞株生長曲線，對Integrin β1在缺氧早期促血管內(nèi)皮細胞增殖效應中的作用進行了初步研究。 二、結(jié)果 1．通過Long SAGE技術(shù)構(gòu)建了常氧和缺氧臍靜脈內(nèi)皮細胞Long SAGE文庫，缺氧SAGE文庫測得30,756個標簽，其中識別出的基因(即unique tag)總數(shù)為13879，比例為45.13％；重復的雙標簽體總數(shù)為762，比例為2.40％。常氧SAGE文庫測得標簽數(shù)為31213，其中識別出的基因

8、總數(shù)為13665，比例為43.78％；重復的雙標簽體總數(shù)為758，比例為2.40％。文庫中共有112個基因表達量出現(xiàn)明顯差異(P<0.05)，涵蓋編碼細胞代謝酶類，核糖體蛋白，生長因子，轉(zhuǎn)錄和翻譯調(diào)節(jié)因子等，其中缺氧后明顯上調(diào)的基因為62個，包括信號轉(zhuǎn)導和轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子GPCR5A和C11ORF13，以及促血管生成因子ANGPLT4等；而顯著下調(diào)基因為50個，包含參與離子結(jié)合和防御反應的基因如HMOX1、SOD1、FTH1、CTGF、OT

9、UB1等；這些基因被視為缺氧后有顯著差異表達的基因，納入后續(xù)生物信息學分析中。 2．生物信息學分析：綜合基因富集分析和GO分析結(jié)果，發(fā)現(xiàn)缺氧早期由于負調(diào)控增殖基因群的表達受到明顯抑制(共有4個負調(diào)控基因出現(xiàn)顯著差異表達，其中CAV1，GJA1，HMOX1表達下調(diào)，NME1表達上調(diào))，總趨勢是促進細胞增殖；另外，缺氧早期P13K通路被顯著激活，而TGF-β受體和Notch信號通路被抑制。由于抗凋亡基因(HSPA1A，ANXA1，C

10、FL1，HMOXl)表達明顯下調(diào)，促使缺氧早期凋亡發(fā)生；另有71個參與細胞周期調(diào)節(jié)的基因表達發(fā)生改變，使細胞周期進程受到影響；由于血管生成素樣蛋白4(ANGPTL4)表達顯著上調(diào)，促進了血管內(nèi)皮細胞的血管發(fā)生潛能；由于ITGB1，ITGA6，THBS1，LAMB3，CD47，COL5A1，F(xiàn)NDC4，ITGA2，ITGA10黏附分子表達上調(diào)，促進ECM受體相互作用；由于脂代謝相關(guān)基因ANGPTLA表達明顯上調(diào)，脂代謝加強，但ATP合成和

11、轉(zhuǎn)運卻減少；雖然細胞對溫度反應能力增強，但總體而言細胞對外界刺激反應減弱，使臍靜脈內(nèi)皮細胞對外界防御能力降低。 3．熒光定量PCR結(jié)果表明EA.hy926細胞缺氧處理3 h后，ANGPTL4、HNRPDLmRNA表達上調(diào)；FTH1，HMOX1，CTGF mRNA表達下調(diào)，其變化趨勢和SAGE文庫中豐度變化情況一致。 4．從SAGE文庫中挑選的3個無匹配標簽通過GLGI均得到不同程度延伸，經(jīng)BLAST后與已知基因匹配，分別

12、是微管蛋白β2C、核糖體蛋白SA、核糖體蛋白L41。 5．據(jù)生物信息學分析對缺氧早期細胞增殖和凋亡改變的功能驗證，證實缺氧早期此兩項細胞功能的改變與文庫生物信息學分析結(jié)果吻合。缺氧早期血管內(nèi)皮細胞生長曲線左移，增殖指數(shù)于缺氧1 h即明顯升高，持續(xù)到缺氧6 h，缺氧12 h較正常對照下降；VEGF和PCNA表達均于缺氧早期升高，提示缺氧早期促進細胞增殖。缺氧后3 h，12 h細胞凋亡發(fā)生率明顯增高，提示缺氧早期促凋亡發(fā)生。

13、 6．缺氧后Integrin β1啟動子活性明顯增強，其蛋白表達明顯增加；Integrin β1 RNA干擾可以明顯下調(diào)。Integrinβ1蛋白的表達，抑制EA.hy926細胞的增殖；缺氧處理后，，Integrin β1下調(diào)細胞株和正常EA.hy926細胞增殖曲線均發(fā)生明顯左移，但正常EA.hy926細胞生長曲線左移程度較Integrin β1下調(diào)細胞株更大，兩者差別具有統(tǒng)計學意義，提示缺氧早期通過上調(diào)Integrin β1表達，促進

14、EA.hy926細胞的增殖。 三、結(jié)論 1．采用Long SAGE技術(shù)成功構(gòu)建了人臍靜脈內(nèi)皮細胞常氧和缺氧3 h Long SAGE文庫，獲得涵蓋上萬個轉(zhuǎn)錄本信息的表達譜數(shù)據(jù)，鑒定出112個差異表達基因(P<0.05)。 2．缺氧早期以多種基因的激活或抑制方式，調(diào)節(jié)多種信號分子的表達，促進細胞增殖、脂代謝、血管生成，有利于啟動血管內(nèi)皮細胞自身保護性機制；同時細胞凋亡增加，細胞周期進程受影響，細胞防御能力降低；文庫