家蠶Bmbuffy基因的克隆及其表達(dá)分析.pdf

1、近年來，細(xì)胞凋亡在線蟲、果蠅、哺乳動(dòng)物三大模式生物的研究中取得了豐碩的成果。家蠶作為鱗翅目昆蟲的典型代表，也是良好的模式生物，但對(duì)其細(xì)胞凋亡的研究尚處于初級(jí)階段。Bcl-2基因作為細(xì)胞凋亡線粒體途徑中的關(guān)鍵調(diào)節(jié)基因，自從1985年Tsujimoto等在研究濾泡狀B細(xì)胞淋巴瘤時(shí)發(fā)現(xiàn)以來，受到廣泛的關(guān)注。該基因是一個(gè)原癌基因，它本身既不能促使惡性轉(zhuǎn)化，也不能促進(jìn)細(xì)胞增殖，但它可以在無神經(jīng)營養(yǎng)因子和生長因子的條件下延長細(xì)胞的存活時(shí)間。Bcl-

2、2對(duì)于由多種細(xì)胞毒素引起的細(xì)胞凋亡均有抑制作用。本文基于其他模式生物的先進(jìn)研究成果及家蠶基因組信息，分析并克隆了果蠅Buffy基因的家蠶同源基因Bmbuffy，并對(duì)其表達(dá)進(jìn)行了研究，得到了如下研究結(jié)果。
　　 1家蠶Bmbuffy基因的克隆及序列分析
　　 利用家蠶EST數(shù)據(jù)電子克隆了果蠅Dmbuffy基因在家蠶中的同源體。命名為Bmbuffy。通過Race技術(shù)成功克隆了家蠶BmBuffy基因的完整cDNA序列，全長為1

3、632bp，其ORF長879bp(ORF：362-1241)，編碼292個(gè)氨基酸，預(yù)測蛋白的分子量大小為32.4kDa，等電點(diǎn)為9.94。通過結(jié)構(gòu)域預(yù)測，編碼蛋白的第130個(gè)氨基酸到第241個(gè)氨基酸之間，有一個(gè)Bcl-2家族的保守結(jié)構(gòu)域?；蚪M序列分析結(jié)果顯示BmBuffy基因由6個(gè)外顯子組成，外顯子/內(nèi)含子邊界符合GT-AG規(guī)則；前5個(gè)外顯子位于7號(hào)染色體的兩條scaffold上，而第6個(gè)外顯子位于4號(hào)染色體上。
　　 2家蠶

4、Bmbuffy基因的原核表達(dá)
　　 根據(jù)BmBuffy基因的完整cDNA序列設(shè)計(jì)引物，體外克隆BmBuffy基因的ORF。將整個(gè)編碼區(qū)序列亞克隆到pET-28a-c(+)表達(dá)載體，構(gòu)建重組表達(dá)質(zhì)粒，將該重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到BL21表達(dá)宿主菌中，用IPTG誘導(dǎo)Bmbuffy/pET-28a-c(+)/BL21表達(dá)目的蛋白。由于加了組氨酸標(biāo)簽，目的蛋白大小為36.2kD，與預(yù)測結(jié)果一致。該蛋白以包涵體的形式存在。IPTG濃度，誘導(dǎo)溫度和誘

5、導(dǎo)時(shí)間對(duì)Bmbuffy蛋白的表達(dá)影響不大，本實(shí)驗(yàn)最終采用1.0mM IPTG、37℃誘導(dǎo)4h來誘導(dǎo)目的蛋白的表達(dá)。
　　 3家蠶Bmbuffy蛋白抗體的制備
　　 以純化的Bmbuffy蛋白為抗原制備了抗體，并用飽和硫酸銨鹽析法純化，通過間接ELISA法檢測抗體效價(jià)為1:32000。
　　 4家蠶Bmbuffy基因在凋亡細(xì)胞中的表達(dá)
　　 將正常BmE-SWU1細(xì)胞、UVC和放線菌素D凋亡誘導(dǎo)后24 h的

6、BmE-SWU1細(xì)胞進(jìn)行凋亡檢測并對(duì)家蠶Bmbuffy、BmDredd和BmGsk3基因進(jìn)行表達(dá)譜分析。結(jié)果顯示，UVC和放線菌素D誘導(dǎo)后的BmE-SWU1細(xì)胞中，核固縮，染色質(zhì)凝集，最后核裂解，可見清晰的熒光碎片凋亡小體，呈現(xiàn)典型的細(xì)胞凋亡特征；放線菌素D誘導(dǎo)后的BmE-SWU1細(xì)胞中，Bmbuffy、BmGsk3基因的表達(dá)量有所下降，但不太明顯，BmDredd基因的表達(dá)量上升；UVC誘導(dǎo)后的BmE-SWU1細(xì)胞中，Bmbuffy和B