版權(quán)說明:本文檔由用戶提供并上傳,收益歸屬內(nèi)容提供方,若內(nèi)容存在侵權(quán),請(qǐng)進(jìn)行舉報(bào)或認(rèn)領(lǐng)
文檔簡介
1、近年來,細(xì)胞凋亡在線蟲、果蠅、哺乳動(dòng)物三大模式生物的研究中取得了豐碩的成果。家蠶作為鱗翅目昆蟲的典型代表,也是良好的模式生物,但對(duì)其細(xì)胞凋亡的研究尚處于初級(jí)階段。Bcl-2基因作為細(xì)胞凋亡線粒體途徑中的關(guān)鍵調(diào)節(jié)基因,自從1985年Tsujimoto等在研究濾泡狀B細(xì)胞淋巴瘤時(shí)發(fā)現(xiàn)以來,受到廣泛的關(guān)注。該基因是一個(gè)原癌基因,它本身既不能促使惡性轉(zhuǎn)化,也不能促進(jìn)細(xì)胞增殖,但它可以在無神經(jīng)營養(yǎng)因子和生長因子的條件下延長細(xì)胞的存活時(shí)間。Bcl-
2、2對(duì)于由多種細(xì)胞毒素引起的細(xì)胞凋亡均有抑制作用。本文基于其他模式生物的先進(jìn)研究成果及家蠶基因組信息,分析并克隆了果蠅Buffy基因的家蠶同源基因Bmbuffy,并對(duì)其表達(dá)進(jìn)行了研究,得到了如下研究結(jié)果。
1家蠶Bmbuffy基因的克隆及序列分析
利用家蠶EST數(shù)據(jù)電子克隆了果蠅Dmbuffy基因在家蠶中的同源體。命名為Bmbuffy。通過Race技術(shù)成功克隆了家蠶BmBuffy基因的完整cDNA序列,全長為1
3、632bp,其ORF長879bp(ORF:362-1241),編碼292個(gè)氨基酸,預(yù)測蛋白的分子量大小為32.4kDa,等電點(diǎn)為9.94。通過結(jié)構(gòu)域預(yù)測,編碼蛋白的第130個(gè)氨基酸到第241個(gè)氨基酸之間,有一個(gè)Bcl-2家族的保守結(jié)構(gòu)域?;蚪M序列分析結(jié)果顯示BmBuffy基因由6個(gè)外顯子組成,外顯子/內(nèi)含子邊界符合GT-AG規(guī)則;前5個(gè)外顯子位于7號(hào)染色體的兩條scaffold上,而第6個(gè)外顯子位于4號(hào)染色體上。
2家蠶
4、Bmbuffy基因的原核表達(dá)
根據(jù)BmBuffy基因的完整cDNA序列設(shè)計(jì)引物,體外克隆BmBuffy基因的ORF。將整個(gè)編碼區(qū)序列亞克隆到pET-28a-c(+)表達(dá)載體,構(gòu)建重組表達(dá)質(zhì)粒,將該重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到BL21表達(dá)宿主菌中,用IPTG誘導(dǎo)Bmbuffy/pET-28a-c(+)/BL21表達(dá)目的蛋白。由于加了組氨酸標(biāo)簽,目的蛋白大小為36.2kD,與預(yù)測結(jié)果一致。該蛋白以包涵體的形式存在。IPTG濃度,誘導(dǎo)溫度和誘
5、導(dǎo)時(shí)間對(duì)Bmbuffy蛋白的表達(dá)影響不大,本實(shí)驗(yàn)最終采用1.0mM IPTG、37℃誘導(dǎo)4h來誘導(dǎo)目的蛋白的表達(dá)。
3家蠶Bmbuffy蛋白抗體的制備
以純化的Bmbuffy蛋白為抗原制備了抗體,并用飽和硫酸銨鹽析法純化,通過間接ELISA法檢測抗體效價(jià)為1:32000。
4家蠶Bmbuffy基因在凋亡細(xì)胞中的表達(dá)
將正常BmE-SWU1細(xì)胞、UVC和放線菌素D凋亡誘導(dǎo)后24 h的
6、BmE-SWU1細(xì)胞進(jìn)行凋亡檢測并對(duì)家蠶Bmbuffy、BmDredd和BmGsk3基因進(jìn)行表達(dá)譜分析。結(jié)果顯示,UVC和放線菌素D誘導(dǎo)后的BmE-SWU1細(xì)胞中,核固縮,染色質(zhì)凝集,最后核裂解,可見清晰的熒光碎片凋亡小體,呈現(xiàn)典型的細(xì)胞凋亡特征;放線菌素D誘導(dǎo)后的BmE-SWU1細(xì)胞中,Bmbuffy、BmGsk3基因的表達(dá)量有所下降,但不太明顯,BmDredd基因的表達(dá)量上升;UVC誘導(dǎo)后的BmE-SWU1細(xì)胞中,Bmbuffy和B
溫馨提示
- 1. 本站所有資源如無特殊說明,都需要本地電腦安裝OFFICE2007和PDF閱讀器。圖紙軟件為CAD,CAXA,PROE,UG,SolidWorks等.壓縮文件請(qǐng)下載最新的WinRAR軟件解壓。
- 2. 本站的文檔不包含任何第三方提供的附件圖紙等,如果需要附件,請(qǐng)聯(lián)系上傳者。文件的所有權(quán)益歸上傳用戶所有。
- 3. 本站RAR壓縮包中若帶圖紙,網(wǎng)頁內(nèi)容里面會(huì)有圖紙預(yù)覽,若沒有圖紙預(yù)覽就沒有圖紙。
- 4. 未經(jīng)權(quán)益所有人同意不得將文件中的內(nèi)容挪作商業(yè)或盈利用途。
- 5. 眾賞文庫僅提供信息存儲(chǔ)空間,僅對(duì)用戶上傳內(nèi)容的表現(xiàn)方式做保護(hù)處理,對(duì)用戶上傳分享的文檔內(nèi)容本身不做任何修改或編輯,并不能對(duì)任何下載內(nèi)容負(fù)責(zé)。
- 6. 下載文件中如有侵權(quán)或不適當(dāng)內(nèi)容,請(qǐng)與我們聯(lián)系,我們立即糾正。
- 7. 本站不保證下載資源的準(zhǔn)確性、安全性和完整性, 同時(shí)也不承擔(dān)用戶因使用這些下載資源對(duì)自己和他人造成任何形式的傷害或損失。
最新文檔
- 家蠶整合蛋白β基因的克隆及其表達(dá)分析.pdf
- 家蠶Bmtol基因的克隆鑒定及表達(dá)分析.pdf
- 家蠶Elav基因的克隆分析和時(shí)空表達(dá)研究.pdf
- 家蠶鐵蛋白基因的克隆、表達(dá)及其生物學(xué)分析.pdf
- 家蠶UBRPS27a基因克隆、表達(dá)及其功能的研究.pdf
- 家蠶SCPx-SCP2基因的克隆和表達(dá)分析.pdf
- 家蠶溶繭酶基因的克隆、表達(dá)及其啟動(dòng)子的活性分析.pdf
- 家蠶SCI-SB基因克隆及其原核表達(dá)的研究.pdf
- 家蠶BmNADK基因的克隆分析及其與家蠶高溫應(yīng)激反應(yīng)的相關(guān)研究.pdf
- 家蠶BmDredd基因的克隆及其功能初探.pdf
- 小鼠a基因的克隆及其表達(dá)分析
- 家蠶先天免疫相關(guān)基因Bmimd的克隆、表達(dá)及序列分析.pdf
- 家蠶BmNAT基因的克隆、表達(dá)分析及乙?;芯?pdf
- 家蠶和蜜蜂中Piwi蛋白基因的克隆與表達(dá)譜分析.pdf
- 家蠶mago nashi基因的克隆、序列分析及原核表達(dá)研究.pdf
- 家蠶表皮型幾丁質(zhì)合成酶基因的克隆及表達(dá)分析.pdf
- 家蠶假想基因Bm-P312的克隆表達(dá)及其定位研究.pdf
- 家蠶BmeIF4E基因的克隆、表達(dá)及功能分析.pdf
- 31206.家蠶表皮高豐度表達(dá)基因bmgcp2的克隆、表達(dá)及分析
- 家蠶GMCβ2基因的克隆、表達(dá)及功能初探.pdf
評(píng)論
0/150
提交評(píng)論